MCM2基因和蛋白在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

程甜甜 楊賢子 駱志國

MCM2屬于微小染色體維持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins，MCMs)的成員之一。MCM2蛋白與其他家族成員形成復制前復合物可作為DNA復制的“通行證”，在所有真核細胞的DNA復制中起到重要作用[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)MCM2作為細胞增殖特異性標志優(yōu)于常見的細胞增殖指標Ki-67，能夠更客觀和全面的反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)[2]。本研究通過檢測乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白水平的表達變化，進一步探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有標本隨機取自2012年03月1日-2013年05月1日湖北省十堰市太和醫(yī)院乳腺外科住院患者的手術(shù)切除組織。全組病例均經(jīng)病理檢查確診，其中乳腺惡性腫瘤54例，乳腺良性疾病12例，以乳腺良性疾病手術(shù)切除的正常乳腺組織(10例)作為對照組。54例乳腺惡性腫瘤包括35例浸潤性導管癌、6例乳腺導管內(nèi)癌、2例乳腺小葉原位癌、3例髓樣癌、5例單純癌、其他3例。其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。12例乳腺良性疾病包括乳腺纖維腺瘤、乳腺腺病、乳腺囊性小葉增生，患者術(shù)前均未行放療、化療、激素和中草藥物等治療。手術(shù)標本于-80℃凍存。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同乳腺癌組織MCM2mRNA的表達

所有PCR引物均用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，引物序列由上海生工生物工程公司合成。MCM2引物序列上游：5’-CACGCTTTGACATCCTGTG-3’；下游：5’-TGTTGATCTGACGAGCCTTA-3’，PCR產(chǎn)物大小為657 bp。GAPDH引物序列上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；引物下游：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，PCR產(chǎn)物大小為113 bp。分別稱取0.1 g的正常乳腺組織、乳腺良性疾病組織和乳腺癌組織，用勻漿器將組織碾磨碎后按照Trizol試劑(MRCGENE公司)說明書提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套試劑盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。PCR擴增條件為：95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)。取10 μl的擴增產(chǎn)物在EB染色的2%瓊脂糖凝膠中電泳。用凝膠成像掃描分析系統(tǒng)(英國Syngene公司的GeneGenius)測定所有條帶，應(yīng)用GeneTools軟件分析所有條帶各自峰面積值,定義為該條帶的吸光度值(OD)。以GAPDH為內(nèi)參照基因，MCM2基因mRNA的相對表達量則用MCM2基因(T)與內(nèi)參照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD ratio)表示。MCM2基因mRNA檢測經(jīng)歷3次獨立性重復檢測。

1.3 Western blotting檢測MCM2蛋白的表達

用總蛋白提取試劑盒(Applygen公司)提取所有標本的總蛋白。簡而言之，將0.1 g的所有標本剪碎后加入1 ml裂解液，然后放入勻漿器將組織碾磨均勻。取0.5 ml組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管。每0.5 ml組織勻漿液加入2倍體積的(1 ml)抽提試劑充分混勻。室溫或4 ℃靜置10 min后，4℃下10 000 r/min離心10 min，棄去上下層液體，無水乙醇洗滌中層蛋白膜后溶于4℅ SDS，使用BCA法蛋白含量測定試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)檢測提取的蛋白濃度。取等量的蛋白(25 μg)上樣于12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后加入抗MCM2的一抗(美國Santa Cruz公司，按1∶300稀釋)在4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，用DAB試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)顯影。MCM2蛋白檢測經(jīng)歷3次獨立的重復性檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用獨立樣本的t檢驗(independent sample t-test)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05判定差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(M±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 正常乳腺組織和良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達

與正常的乳腺組織相比，良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達水平均增高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。RT-PCR和Western-blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，良性和惡性乳腺腫瘤組織之間MCM2 mRNA和蛋白的表達水平也存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.2 MCM2表達與乳腺癌組織臨床分期的關(guān)系

由圖1和圖2中可以看出，不同TNM分期的乳腺癌組織中MCM2表達存在著差異。其中Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織MCM2 mRNA和蛋白的表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌組織(P<0.05)，見表1。而Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期乳腺癌組織間MCM2的表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為Ⅰ期乳腺癌組織；6為Ⅱ期乳腺癌組織；7為Ⅲ期乳腺癌組織；8為Ⅳ期乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為Ⅰ期乳腺癌組織；4為Ⅱ期乳腺癌組織；5為Ⅲ期乳腺癌組織；6為Ⅳ期乳腺癌組織。

表1 不同TNM分期乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達量(M±SD)

注：mRNA相對表達量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

2.3 MCM2表達與乳腺癌組織臨床病理特征的關(guān)系

由圖3和圖4可見，低、中、高分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達量存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。其中，低分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達量較高分化的增高(P<0.01)，見表2和圖4。

表2 不同分化程度乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達量(M±SD)

注：mRNA相對表達量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為高分化乳腺癌組織；6為中分化乳腺癌組織；7為低分化乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為低分化乳腺癌組織；4為中分化乳腺癌組織；5為高分化乳腺癌組織。

3 討論

2012年中國腫瘤登記中心發(fā)布最新數(shù)據(jù)指出乳腺癌是我國女性排名第一位的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其是在城市。隨著醫(yī)療水平的進步，雖然我國乳腺癌的治愈率和5年生存率明顯提高，但乳腺癌的早期診斷仍不理想。因早期的腫瘤細胞增殖能力較強，故腫瘤的早期診斷主要通過對其相關(guān)的增殖標志物來判斷。目前臨床上常用的乳腺癌增殖標志物包括PCNA、Ki-67等。MCM蛋白家族是真核生物DNA復制的必需因子，在DNA復制起始和延伸過程中起到關(guān)鍵性作用[3]。Osaki等研究發(fā)現(xiàn)：與常用的增殖指標PCNA和Ki-67蛋白相比，MCM2蛋白能夠更敏感而更特異地反映細胞的增殖情況[4]。隨后國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，MCM2蛋白能夠較好的區(qū)分正常組織、不典型增生組織和腫瘤組織，可以作為結(jié)直腸癌、肝細胞肝癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤的重要生物學標志，在判斷腫瘤的惡性度及評估預(yù)后方面具有重要意義[2,5-7]。

我們前期使用免疫組化S-P法，得出MCM2在乳腺癌中的表達主要在細胞核內(nèi)。MCM2在乳腺癌不同TNM分期、不同病理組織學分級(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均有顯著性差異，且呈逐漸升高趨勢。MCM2和Ki-67在乳腺癌中的表達呈平行關(guān)系(P<0.001)，且作用優(yōu)于Ki-67[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCM2在乳腺癌mRNA和蛋白水平的表達均較高，這與我們在免疫組化中得到的結(jié)果一致。這一現(xiàn)象提示MCM2的表達過量可能導致正常乳腺細胞不斷進入細胞周期，反復啟動DNA復制和延伸，從而使DNA突變率增加，最終導致乳腺細胞發(fā)生癌變。同時，MCM2 mRNA和蛋白的表達量在乳腺癌不同的TNM分期和不同的病理類型之間存在著統(tǒng)計學的差異(P<0.05)，但在Ⅰ期和Ⅱ期之間、Ⅲ期和Ⅳ期之間MCM2的表達卻無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。這提示MCM2可能對反映乳腺癌細胞惡性程度和異常分化有重要的參考價值，從而可用來判斷臨床治療和預(yù)后評估等。

本研究結(jié)果從mRNA和蛋白表達水平上再次證實MCM2可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對癌前病變、惡性程度及預(yù)后判定具有一定的臨床意義。進一步深入研究MCM2表達調(diào)控在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制，可能找到預(yù)防和治療乳腺癌的方法。MCM2可能成為乳腺癌基因治療一個新的潛在分子靶點。

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