乳腺癌耐藥細(xì)胞株中P-gp、CD147和E-cadherin表達(dá)的意義

閻 良 吳雪卿 黃建平 龐惠芳

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來乳腺癌的發(fā)病率有明顯的增高?；瘜W(xué)藥物治療作為乳腺癌術(shù)前或術(shù)后輔助治療得到了廣泛的應(yīng)用，腫瘤體積大的乳腺癌術(shù)前短期化療可使腫瘤體積縮小，有利于手術(shù)切除，但對(duì)術(shù)后長(zhǎng)期的化療以及無法手術(shù)患者姑息性化療的意義有不同的意見。近年來的研究發(fā)現(xiàn)化療藥物誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)和侵襲轉(zhuǎn)移之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，乳腺癌細(xì)胞在MDR藥物作用下不但P-gp和EMMPRIN(CD147)表達(dá)增強(qiáng)，還可能出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，這種轉(zhuǎn)化有利于腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物的攻擊，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[1]。但EMT的發(fā)生與mdr基因活化的關(guān)系尚不清楚。本課題通過比較不耐藥乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、相應(yīng)的用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/Adr)和多耐藥基因1(multidrug resistance gene1，mdr1)導(dǎo)入建立的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/MDR1)中P-gp、CD147和E-cadherin(E-cd)的表達(dá)，以探討MDR基因與CD147表達(dá)以及腫瘤細(xì)胞EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

不耐藥乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)和相應(yīng)的用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/Adr)購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，mdr1導(dǎo)入建立的乳腺癌耐藥細(xì)胞株(MCF-7/MDR1)由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系惠贈(zèng)。細(xì)胞用RPMI 1640 (gibco BRL，karlsruhe，germany)培養(yǎng)液培養(yǎng)(Thermo培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái))，培養(yǎng)液中含有10%小牛血清、100 U/mL盤尼西林及100 μg/mL鏈霉素，37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。每隔48 h換培養(yǎng)液。用0.25%的胰蛋白酶消化，收集并傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2 Western blot方法

收集細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗，置細(xì)胞裂解液(50 mM pH 8.0 Tris-HCl，150 mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，0.5% NaN3，2 mM EDTA，25×蛋白酶抑制劑)，冰浴30 min，4℃離心(12，000 r/min，10 min)收集上清，按照BCA Protein Assay Kit定量。不連續(xù)(8%分離膠和5%的濃縮膠)垂直SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad)電泳，每孔上樣蛋白50 μg，電泳完成后，蛋白條帶經(jīng)濕式轉(zhuǎn)移儀(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)3%脫脂奶粉封閉，用鼠抗抗人P-gp (Chemicon公司)、兔抗人E-cadherin (Santa Cruz公司)、鼠抗人CD147(Santa Cruz公司)和β-actin抗體(Sigma公司)37℃孵育1 h，4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Amersham Pharmacia Biotech)37℃孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯示條帶(ECL kit，amersham pharmacia biotech)。

2 結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示三株細(xì)胞中P-gp、CD147和E-cd存在差異表達(dá)。由圖1可見，P-gp在不耐藥細(xì)胞中表達(dá)很弱，而在兩株耐藥細(xì)胞中均呈高表達(dá)。CD147在不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中的表達(dá)相近，在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，而且其條帶的位置偏下，提示其分子量較小。而E-cd在不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中均有表達(dá)，在后者中表達(dá)更為明顯，但在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中無表達(dá)。

圖1 Western blot 檢測(cè)結(jié)果

3 討論

P-gp是mdr1編碼的跨膜糖蛋白，人類的mdr1基因位于第7號(hào)染色體上，全長(zhǎng)約330 kb，轉(zhuǎn)錄41～45 kb的高度同源的RNA，翻譯的氨基酸殘基分子量約為140 kD，其翻譯后修飾加上去的糖鏈約為30 kD，兩者總分子量為170 kD，即為P-gp。P-gp可以利用它的疏水位點(diǎn)與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P-gp在2株耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，不耐藥細(xì)胞中表達(dá)很弱，提示敏感乳腺癌細(xì)胞株MCF-7經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)或mdr1基因轉(zhuǎn)染均可表達(dá)P-gp，從而產(chǎn)生耐藥性。

CD147為分子量50 000～60 000的跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員[3]，已被證實(shí)為廣泛存在于腫瘤細(xì)胞中[4-7]。在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在mdr1基因?qū)氲哪退幖?xì)胞與藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞CD147的表達(dá)不同，前者與不耐藥細(xì)胞的表達(dá)相似，而在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，提示mdr1基因?qū)胍鸬腜-gp表達(dá)增多本身并不能直接影響CD147的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道CD147轉(zhuǎn)染能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株MMPs的表達(dá)，加速在裸鼠內(nèi)的成瘤性，并促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[8]。也有報(bào)道CD147還能影響乳腺癌細(xì)胞mdr1基因轉(zhuǎn)錄和P-gp表白的表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)的而藥細(xì)胞株中CD147不但表達(dá)增強(qiáng)，而且其條帶的位置偏下，提示其分子量較小，這可能與其糖化程度有關(guān)，而一般認(rèn)為CD147分子的糖化對(duì)促進(jìn)MMPs表達(dá)等作用的體現(xiàn)是必需的[10]。這種表達(dá)量和糖化水平的不同是否可能與藥物誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)入引起的耐藥細(xì)胞株許多不同的生物學(xué)表現(xiàn)有關(guān)尚有待深入研究。

上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過程[11]。EMT是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，在腫瘤細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道高劑量的阿霉素可能誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為E-cd、CK19表達(dá)降低，α-SMA、vimentin表達(dá)升高，同時(shí)癌細(xì)胞的耐藥性和體外侵襲力也得以增強(qiáng)[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不耐藥細(xì)胞和導(dǎo)入mdr1基因細(xì)胞中E-cd均有表達(dá)，但在藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中E-cd陰性，這顯示基因?qū)肱c藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的差異性，即藥物誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株可能具有更為明顯的EMT傾向，這也可以解釋MCF-7/Adr乳腺癌細(xì)胞為什么比MCF7和MCF7/MDR1具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這種差異顯然也并不是mdr1基因或P-gp蛋白表達(dá)增高的直接結(jié)果，進(jìn)一步探討其內(nèi)在聯(lián)系和可能的影響環(huán)節(jié)將具有明顯的理論意義和臨床應(yīng)用前景。

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