Real time-PCR檢測(cè)循環(huán)DNA基因?qū)υl(fā)性肝癌的臨床診斷價(jià)值

郭麗萍

原發(fā)性肝癌(prjmary hepatic cancer，PHC)是肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生癌變導(dǎo)致的肝癌，是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，主要包括肝細(xì)胞癌(hepatic cellular cancer，HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic bile duct cellular cancer，ICC)和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合型等不同病理類型，其中90%患者為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。目前血清AFP是診斷肝癌(HCC)的重要指標(biāo)和特異性最強(qiáng)的腫瘤標(biāo)記物，國(guó)內(nèi)常用于肝癌的普查、早期診斷、術(shù)后監(jiān)測(cè)和隨訪；在本研究中，我們采用real time-PCR方法，通過檢測(cè)血漿循環(huán)DNA載量表達(dá)情況，探討循環(huán)DNA的臨床早期篩查價(jià)值，為循環(huán)DNA作為原發(fā)性肝癌早期篩查腫瘤標(biāo)志物提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2008年6月至2013年6月于我院收治的肝病患者，根據(jù)《中國(guó)常見惡性腫瘤診療規(guī)范》第二分冊(cè)原發(fā)性肝癌或《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》診療標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)臨床癥狀、影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物及病理檢查診斷為原發(fā)性肝癌后確定為研究對(duì)象[2-3]。經(jīng)診斷符合本研究目的患者共63例，男性41例(65.1%)，女性22例(34.9%)，平均年齡為(58±19.6)歲，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例(57.1%)。此外選取25例經(jīng)體檢健康的志愿者作為正常對(duì)照組，平均年齡為(56±18.6)歲。

1.2 血漿DNA提取

無菌采取研究對(duì)象患者組及對(duì)照組志愿者血液2～3 ml，分離血漿，根據(jù)天根DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取血液基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物及熒光探針設(shè)計(jì)合成

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)選取β-globin 基因(GenBank ID:U01317)作為目的基因分析循環(huán)DNA血液載量，引物為，β-globin-F：5’-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3’；β-globin-P：5’-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3’；Taqman熒光探針：5’-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMAAR)-3’。上述所有引物序列均由Invitrogen(北京)公司合成。

1.4 循環(huán)DNA real time-PCR載量檢測(cè)

Real-Time PCR檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和對(duì)照組志愿者人群循環(huán)DNA血漿載量，采用ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Lifetechnology公司，美國(guó))和TransStart?Probe qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，按試劑盒實(shí)驗(yàn)說明書推薦體系(20 μl)及說明書中的PCR(三步法)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；采用ABI Taqman質(zhì)控試劑盒(Lifetechnology公司，美國(guó))，以104ng/ml、103ng/ml、102ng/ml、101ng/ml、100ng/ml作為終濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)real time-PCR檢測(cè)樣品Ct值及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算原發(fā)性肝癌患者和對(duì)照組志愿者血漿循環(huán)DNA載量，比較原發(fā)性肝癌患者確診前后血漿循環(huán)DNA含量、原發(fā)性感染淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前后血漿循環(huán)DNA含量，及與對(duì)照組血漿DNA含量的比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌確診前后血漿循環(huán)DNA載量變化

檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者確診前24個(gè)月及確診后血漿循環(huán)DNA的變化，行對(duì)比分析，結(jié)果顯示：原發(fā)性肝癌患者確診后的血漿循環(huán)DNA載量顯著高于確診前(P<0.01)，也顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；確診前6個(gè)月血漿循環(huán)DNA載量顯著高于確診前12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月及對(duì)照組的(P<0.01)；確診前12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月血漿循環(huán)DNA載量與對(duì)照組相比，雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但數(shù)值上也高于對(duì)照組，且確診前24個(gè)月至確診前12個(gè)月血漿循環(huán)DNA載量呈上升趨勢(shì)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1，圖1)。

表1 原發(fā)性肝癌患者確診前后及對(duì)照組血漿循環(huán)DNA載量

圖1 原發(fā)性肝癌患者確診前后及對(duì)照組血漿循環(huán)DNA載量

2.2 原發(fā)性肝癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者間血漿循環(huán)DNA載量比較

比較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌患者血漿DNA載量，結(jié)果顯示：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)性肝癌患者血漿DNA載量[(79.3±13.7 )ng/ml]顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)性肝癌患者[(52.1±12.5)ng/ml]，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.01，兩組間差異顯著(圖2)。

圖2 原發(fā)性肝癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者間血漿循環(huán)DNA載量比較

3 討論

循環(huán)DNA(circulating DNA)又稱循環(huán)核酸，是1種游離于細(xì)胞外的、存在于各種體液中的DNA。Mandel和Metais于1947年最早發(fā)現(xiàn)了循環(huán)DNA的存在，但是受當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)條件和方法的限制并沒能查明其余疾病的關(guān)系[4]。1977年，Leon等于Cancer Research雜志發(fā)表文章稱腫瘤患者血漿循環(huán)DNA載量水平顯著高于健康人群，首次闡明了血漿循環(huán)DNA與腫瘤疾病的關(guān)系[5]。隨后的研究也證實(shí)了腫瘤細(xì)胞DNA 與血漿循環(huán)DNA的關(guān)系，2種DNA之間存在著一致的基因突變[6]。1999-2003年期間召開的3次“血漿/血清循環(huán)核酸在癌癥的診斷、預(yù)后及隨訪的應(yīng)用”研討會(huì)預(yù)言血漿循環(huán)DNA的檢測(cè)將為臨床腫瘤的早期篩查診斷及病程預(yù)測(cè)提供新的微創(chuàng)的、敏感的、特異的分子生物檢測(cè)手段。隨后的關(guān)于肺癌、乳腺癌及鱗癌的研究證實(shí)了血漿循環(huán)DNA在腫瘤病程預(yù)測(cè)及早期篩查中的作用[7]。

張博恒等利用AFP和B超檢查手段對(duì)高危人群每隔6個(gè)月進(jìn)行一次肝癌篩查，結(jié)果顯示早期篩查有助于肝癌早發(fā)現(xiàn)，可使肝癌患者死亡率下降37%，因此，對(duì)高危人群的早期篩查是原發(fā)性肝癌早期發(fā)現(xiàn)的重要途徑[8]。然而，由于AFP 的敏感性和特異度不高，美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)(AASLD)已不再將AFP作為篩查指標(biāo)。在本研究中，我們采用real time-PCR的方法檢測(cè)了血漿循環(huán)DNA在原發(fā)性肝癌臨床早期篩查和診斷的意義，結(jié)果顯示原發(fā)性肝癌確診前的24個(gè)月、18個(gè)月、12個(gè)月的血漿循環(huán)DNA載量和對(duì)照組健康人群的血漿循環(huán)DNA無顯著性差異，但是確診前6個(gè)月的血漿循環(huán)DNA顯著高于24個(gè)月、18個(gè)月和12個(gè)月的血漿循環(huán)DNA載量，而確診后的血漿DNA載量顯著高于確診前的24個(gè)月、18個(gè)月、12個(gè)月和6個(gè)月的血漿DNA載量，這些結(jié)果提示我們確診前6個(gè)月的血漿循環(huán)DNA載量具有診斷性價(jià)值，同時(shí)也提示我們血漿循環(huán)DNA載量在原發(fā)性肝癌早期篩查和診斷的臨床可行性。上述結(jié)果和任寧、張雪峰等的研究結(jié)果是一致的[7,9]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)性肝癌患者和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者血漿循環(huán)DNA分析結(jié)果顯示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌患者血漿DNA載量顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌患者(P<0.01)，提示我們血漿循環(huán)DNA可以作為早期原發(fā)性肝癌篩查和診斷，以及判斷原發(fā)性肝癌病程的一個(gè)有價(jià)值的檢測(cè)指標(biāo)。

在本研究中，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了血漿循環(huán)DNA在原發(fā)性肝癌早期篩查和診斷中的價(jià)值，同時(shí)也可以用于判定原發(fā)性肝癌病程或有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；由于血清甲胎蛋白敏感性和特異性的不足，real time-PCR檢測(cè)血漿循環(huán)DNA有可能成為原發(fā)性肝癌早期篩查和診斷的一個(gè)新臨床標(biāo)準(zhǔn)。

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