恒溫冷凍切片對乳腺癌組織中CerbB-2蛋白表達的影響

高 玟 陳艷紅 劉志良 羅慶豐 黃傳生 涂 侃

乳腺癌是我國婦女高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%。近年來針對HER-2表達的靶向治療方案是主要其輔助治療，是近期乳腺癌規(guī)范治療中的研究熱點[1]。應(yīng)用免疫組化法檢測該腫瘤患者標(biāo)本的CerbB-2蛋白表達情況，是乳腺癌HER-2基因表達重要篩查方法，探索出恒溫冷凍切片后樣本進行檢測CerbB-2蛋白表達是否可行，為CerbB-2蛋白檢測樣本的規(guī)范化處理和乳腺癌的手術(shù)后規(guī)范的輔助治療作出有益的探索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2008年10月-2011年8月期間收治的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者130例，均為女性，年齡37～66歲，平均年齡56.7歲。

1.2 方法

1.2.1 恒溫快速冷凍切片方法 取5 mm厚度組織，加入OCT包埋劑，置入冰凍恒溫快速冷凍切片機冷凍5 min，待OCT包埋劑變白硬化后，按5 μm厚度切片，裱在防脫玻璃片，行HE染色，封片，閱片。

1.2.2 CerbB-2蛋白檢測 采用MaxvisionTM免疫組化法，按照免疫組化試劑盒的操作說明進行。CerbB-2蛋白為工作液，具體步驟：①4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；④抗原修復(fù)：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥加入已知 CerbB-2蛋白抗體，4 ℃冰箱12 h；⑦復(fù)溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨PBS洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，蘇木精復(fù)染，封片[1]。光鏡下觀察CerbB-2蛋白在乳腺癌組織中表達。陽性對照：已知 CerbB-2蛋白強陽性乳腺癌組織切片；陰性對照：已知 CerbB-2蛋白陰性乳腺癌組織切片和PBS代替一抗染色切片。

1.2.3 結(jié)果判斷 細胞膜呈棕黃色顆粒沉著者為CerbB-2蛋白陽性。根據(jù)著色強度及著色癌細胞比例將染色結(jié)果分為-、+、++和+++級：無顯色為-，任何比例的浸潤性癌細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著色為+，浸潤性癌細胞>10%呈現(xiàn)弱至中等程度、完整但不均勻的細胞膜棕黃色著色或浸潤性癌細胞<30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為++，浸潤性癌細胞>30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為+++。

1.3 閱片

在普通光學(xué)顯微鏡下，由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對冷凍切片后對應(yīng)的組織和剩余組織常規(guī)切片，的免疫組化切片進行單獨雙盲閱片,記錄診斷結(jié)果，按配對資料比較兩種方法的一致性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對資料χ2檢驗和一致性檢驗分析。

2 結(jié)果

130例浸潤性導(dǎo)管癌冷凍組織對應(yīng)樣本中42例不表達CerbB-2,33例CerbB-2 表達+，34例CerbB-2 表達++，21例CerbB-2表達 +++;剩余組織常規(guī)切片樣本中56例CerbB-2表達陰性,50例CerbB-2 表達+，19例CerbB-2 表達++，5例CerbB-2表達+++;兩組標(biāo)記結(jié)果比較具有顯著性差異(χ2=134.04,P<0.01)，而且兩組CerbB-2陽性表達結(jié)果一致性較差(kappa值=0.39，P>0.05),見表1。

3 討論

乳腺癌靶向治療是近期發(fā)展較快且有成效的治療手段，CerbB-2是表皮生長因子受體家族成員之一，定位于人17染色體q21區(qū)帶，是185kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，參與多種信號的傳導(dǎo)，已有臨床研究顯示[2]：對于CerbB-2受體過表達的乳腺癌患者，采用1種人源化的單克隆抗體類藥物Herceptin是安全有效的藥物，陰性患者Herceptin無效，表明CerbB-2是乳腺癌靶向治療的有效靶點，但是靶向治療藥物常常費用昂貴，因此準(zhǔn)確檢測乳腺癌CerbB-2表達情況對于乳腺癌術(shù)后規(guī)范的輔助治療具有重要意義。

表1 130例乳腺癌組織中 CerbB-2蛋白表達情況/例

恒溫快速冷凍切片技術(shù)能快速明確各種腫瘤患者的病理診斷和分級，特別是在手術(shù)過程中尤為重要[3]，在乳腺癌患者中顯著提高了診斷準(zhǔn)確率和明確的陰性手術(shù)切緣，在乳腺癌患者規(guī)范化的治療中起到重要作用[4]，該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，但是目前沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)恒溫冷凍切片對于患者CerbB-2蛋白檢測影響的研究，我們選擇了130例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，對恒溫冷凍切片后對應(yīng)同一組織進行石蠟切片CerbB-2蛋白表達檢測，檢測結(jié)果陽性率為3.80%。同時對該患者剩余組織的石蠟切片進行CerbB-2蛋白檢測，陽性結(jié)果16.20%，兩組結(jié)果差異比較具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，在恒溫冷凍切片后對應(yīng)組織的石蠟切片中發(fā)現(xiàn)CerbB-2蛋白出現(xiàn)彌散，定位不準(zhǔn)確，陽性強度減弱等現(xiàn)象，因為CerbB-2蛋白是1種跨膜糖蛋白，在快速冷凍情況下，細胞的細胞膜因溫度的短期內(nèi)激烈的改變產(chǎn)生跨膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而影響陽性表達定位，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)陽性顆粒。研究表明恒溫冷凍切片對乳腺癌Cerb-2表達影響較大，減低Cerb-2陽性表達，因此工作中應(yīng)該盡量避免使用恒溫冷凍切片后的同一樣本進行乳腺癌Cerb-2表達檢測，以免誤導(dǎo)治療，減少患者不必要的醫(yī)療負擔(dān)和浪費。

隨著乳腺癌患者規(guī)范化治療的進展，恒溫冷凍切片技術(shù)應(yīng)用和Her-2蛋白的檢測將會越來越廣泛，本研究發(fā)現(xiàn)恒溫快速冷凍切片技術(shù)會減低免疫組化法檢測Her-2蛋白的陽性表達，對于免疫組化法檢測前檢測樣本的標(biāo)準(zhǔn)化處理流程具有重要意義，同時有必要進一步研究恒溫快冷凍切片技術(shù)對FISH法檢測乳腺癌Her-2基因的影響，更為準(zhǔn)確的提供乳腺癌相關(guān)蛋白和基因檢測前樣本處理的規(guī)范化流程[5]。

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