卵巢癌組織和細胞株中miR-141表達水平與卡鉑耐藥性的關(guān)系

孫彩霞 宋藏珠 徐 慶 景邵武 王 軍

上皮性卵巢癌是女性最致命的的惡性腫瘤之一，在婦科腫瘤中死亡率位居第一。今年來發(fā)病呈現(xiàn)上升趨勢，已經(jīng)嚴重影響女性生命健康。由于目前尚沒有有效的早期診斷方法，70%的患者就診是已屬晚期。對于晚期患者的一般治療手段為腫瘤細胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔以以鉑類為主的聯(lián)合化療方案治療[1]。但是由于腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥性的產(chǎn)生，即使是初始治療的有效率達到70%[2]，但是大部分的卵巢癌患者還是死于耐藥導(dǎo)致的復(fù)發(fā)[3]。所以進展期(晚期)上皮卵巢癌患者5年生存率僅為30%[4]。卵巢癌耐藥產(chǎn)生的分子機制得到了廣泛的研究，但是miRANs在此方面的研究甚少。最新研究發(fā)現(xiàn)，在鉑類耐藥的細胞株A2780中，miR-141表達上調(diào)，當(dāng)在卵巢癌細胞株中過表達miR-141導(dǎo)致其對鉑類藥物的耐受[5]。在本研究中，我們應(yīng)用real-time PCR技術(shù),檢測了miR-141在上皮性卵巢癌組織中的表達水平，以及與卡鉑敏感性的關(guān)系，并檢測轉(zhuǎn)染 miR-141 mimics 后，上皮性卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2對卡鉑敏感度的變化。

1 材料與方法

1.1 標本來源及卵巢癌細胞株

68例上皮性卵巢癌組織標本，均取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科2006年-2007年收治的晚期(FIGOⅢ-Ⅳ期)上皮性卵巢癌住院患者的手術(shù)切除標本，年齡31～78歲，平均(57.2±8.5)歲，患者術(shù)后病理檢查證實為上皮性卵巢癌，且術(shù)前未行放療、化療。正常對照組為30例卵巢癌良性腫瘤標本。組織標本均在標本離體后立即放入液氮罐中，-150 ℃保存。卵巢癌病例均隨訪5年以上。漿液性卵巢癌細胞株SKOV-3和人卵巢透明細胞癌細胞 ES-2由河北醫(yī)科大學(xué)第四院科研中心提供。

1.2 主要試劑

miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)試劑盒，RNA酶抑制劑、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶及10×RT緩沖液(Epicentre公司)，2.5 mM dNTP混合液(HyTest Ltd公司)，SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara公司)，MTT (Sigma公司),miR-141 mimics(Invitrogen公司),Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)，real-time PCR引物及microRNA頸環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物合成(北京中美泰和生物技術(shù)有限公司)，引物見表1。

表1 引物序列表

1.3 miR-141表達水平的測定

按照miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)試劑盒的產(chǎn)品說明書提取所取標本的miRNAs，反轉(zhuǎn)錄得到所測目的基因miR-141和內(nèi)參U6的cDNA，按照YBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara公司)產(chǎn)品說明書,采用real-time PCR方法檢測標本中miR-141的表達情況。采用2-△CT方法表示miR-141的相對表達量，△CT sample=CTsample-CT U6sample。

1.4 術(shù)后規(guī)范化化療及其療效評估

對所有患者進行腫瘤細胞減滅術(shù)后輔以規(guī)范的鉑類為主的聯(lián)合化療方案(紫杉醇 175 mg/m2iv d1,卡鉑 AUC5 iv d1,q21×6)治療。所有病例每2個周期進行一次療效評估，化療結(jié)束后每月進行一次全面評估。將評估結(jié)果分為卡鉑耐藥和卡鉑敏感?？ㄣK耐藥即為卡鉑聯(lián)合化療中病情進展或化療結(jié)束后無化療間隔(TFI)6個月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)；卡鉑敏感即為鉑類化療有效，化療結(jié)束后無化療間隔大于6個月腫瘤復(fù)發(fā)。

1.5 miR-141mimics的轉(zhuǎn)染

用LipofectamineTM 2000將miR-141 mimics轉(zhuǎn)入卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2中，設(shè)為實驗組。同時設(shè)陰性mimics轉(zhuǎn)染的卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2為對照組，未做任何處理的卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2作為陰性組。轉(zhuǎn)染24 h后采用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.6 MTT法檢測細胞增殖抑制率

SKOV-3和ES-2細胞轉(zhuǎn)染24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞懸液，以每空2×103個細胞接種于96孔板中進行細胞培養(yǎng)，并給與卡鉑的干預(yù)，根據(jù)臨床常規(guī)用藥劑量,參考公式log( PPC)=-0.788+[0.755×log( LD50) ][6]得出試驗設(shè)定藥物濃度為320.8 μg /L。每組5個復(fù)孔，同時各設(shè)不加藥對照。分別于干預(yù)24 h、48 h后，每空加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每空加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值(A值)，取相同生長天數(shù)及轉(zhuǎn)染相同質(zhì)粒的A值的均值作為該組細胞某天的A值，計算不同轉(zhuǎn)染組SKOV-3和ES-2細胞相對增殖率。

1.7 克隆形成實驗

SKOV-3和ES-2細胞轉(zhuǎn)染24 h后，取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，3 000個細胞/皿，用含有卡鉑(終濃度為320.8 μg /L)的培養(yǎng)基，同是設(shè)無卡鉑干預(yù)的陰性對照，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5% 的飽和濕度條件下，靜置培養(yǎng)2周。觀察，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加70%乙醇3 ml固定15 min。然后去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布樣本，均數(shù)比較采用兩樣本的t檢驗，不符合正態(tài)分布的樣本比較采用Wilcoxon ’ rank-sum(Mann-Whitney) U檢驗，兩計量樣本的相關(guān)性采用Pearson檢驗，等級標本的相關(guān)性采用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢上皮癌組織和卵巢良性腫瘤中miR-141表達情況

30例卵巢良性腫瘤標本中miR-141平均表達水平為(0.09±0.0032)，68例卵巢上皮癌組織中miR-141平均表達水平為(5.03±0.17)，兩組比較有顯著性差異(P=0.0014)。68例卵巢上皮癌組織中有58例miR-141的表達水平高于良性腫瘤的平均表達水平，占85.3%，其相對表達水平為(5.54±0.11)；10例miR-141的表達水平低于良性腫瘤的平均表達水平，占14.7%，其相對表達水平為(0.03±0.0093)。

2.2 術(shù)后規(guī)范化化療療效

68例患者中除3例化療過程中病情進展外，其余均完成6個周期的規(guī)范化療。卡鉑耐藥患者19例(19/68,27.9%)，卡鉑敏感患者49例(49/68,72.1%)，見表2。

2.3 卵巢上皮癌組織中miR-141表達與卡鉑敏感性及其5年生存率的關(guān)系

卡鉑敏感患者與卡鉑耐藥患者miR-141表達水平存在明顯差異(P=0.002)。miR-141表達與患者對卡鉑的敏感性呈顯著負相關(guān)(γ=-0.782,P=0.003)。生存期超過5年與不足5年患者miR-141的表達存在顯著差異(P=0.032)，miR-141表達與患者生存期呈顯著負相關(guān)性(γ=-0.5296,P=0.013)，見表2。

2.4 miR-141表達與上皮性卵巢癌組織臨床病理特征的關(guān)系

miR-141表達與卵巢上皮癌患者年齡、病理類型、組織學(xué)分級、FIGO分期、殘留腫瘤大小均無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

2.5 real-time PCR 檢測結(jié)果

卵巢癌細胞株SKOV-3和ES轉(zhuǎn)染后，real-time PCR檢測結(jié)果顯示，實驗組miR-141表達水平明顯高于對照組和陰性組，分別為(7.30±0.37)、(1.24±0.19)、(1.50±0.08)(P=0.027，0.033)和(5.97±0.57)、(0.98±0.16)、(1.10±0.07)(P=0.011,0.013)。

2.6 MTT法檢測結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示卡鉑存在的條件下，轉(zhuǎn)染miR-141 mimics組的增殖狀況與其余兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。說明卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2轉(zhuǎn)染miR-141 mimics后對卡鉑的敏感度降低。

2.7 克隆形成實驗檢測結(jié)果

平皿克隆形成實驗結(jié)果顯示：卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2轉(zhuǎn)染miR-141 mimicsd實驗組、陰性mimics對照組和未作處理陰性組的克隆形成率分別為 (72.50±0.99)%、(23±0.90)%、(22±1.03)%和(80.30±0.99)%、(32.15±1.90)%、(35±1.33)%，結(jié)果顯示miR-141 mimicsd實驗組克隆數(shù)及克隆面積明顯高于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而陰性組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

卵巢癌是女性最致命的的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年上升。有70%的患者確診是已屬晚期，對于晚期患者的一般治療手段為腫瘤細胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔以以鉑類為主的聯(lián)合化療方案治療[1]。卡鉑是卵巢癌治療最有效的抗癌藥物之一，介導(dǎo)形成導(dǎo)致細胞死亡的鉑-DNA復(fù)合物。阻礙卡鉑治療成功的主要障礙是藥物耐藥的產(chǎn)生，致使即使初始治療的有效率達到70%[2]，5年生存率也僅為30%[4]。導(dǎo)致藥物耐受的分子機制得到了廣泛的研究，導(dǎo)致鉑類敏感性降低的原因包括谷光氨肽導(dǎo)致的鉑類化合物的失活增加[7]，在細胞內(nèi)的積累減少[8]，凋亡途徑的失活[9]還有就是鉑-DNA損傷修復(fù)的改變[10]。然而，但是miRNAs在這方面的調(diào)節(jié)作用知之甚少。

表2 miR-141表達與卵巢上皮癌對卡鉑敏感性、5年生存率及其臨床病理特征的關(guān)系

圖1 MTT法檢測結(jié)果

MicroRNAs (miRNAs)是一類進化上高度保守的小分子非編碼RNA，長度大約為21-23nt左右，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的功能。他們在組織中的表達有時序性和組織特異性，大約有30%的mRNA的轉(zhuǎn)錄表達受miRNA的調(diào)控，這表明miRNA在整個基因表達中發(fā)揮重要作用[15]。成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合，通過其長度約為2-8nt的種子序列與其靶基因mRNA 3’分翻譯區(qū)(UTR)中的互補序列結(jié)合，抑制其靶基因的表達。約有30%的基因是miRNAs的靶基因，并且一個miRNA的種子序列可能與成百上千個基因的mRNA結(jié)合，即一個miRNA可能靶向作用于成百上千個基因[11]。有研究表明MiR-214/376c/125b的異位表達可分別通過抑制PTEN/ALK7/BAK1的表達增加上皮卵巢癌對鉑類藥物的耐受[12-13]。涉及藥物敏感性的miRNA才剛剛起步，還有大量的工作需要做，以期發(fā)現(xiàn)和確定更多的miRNAs，他們的分子靶點和作用步驟。

本研究中，我們分析了68例上皮性卵巢癌組織中miR-141的表達情況與卡鉑敏感性和患者5年生存率的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致卵巢癌鉑類耐藥的新機制。結(jié)果顯示miR-141表達與患者對卡鉑的敏感性顯著負相關(guān)(γ=-0.7816,P=0.0032)，miR-141的表達與患者5年生存率亦顯著負相關(guān)性(γ=-0.5296,P=0.0128)，轉(zhuǎn)染miR-141mimics后的卵巢癌細胞株SKOV-3和ES-2其卡鉑耐藥性明顯增強。結(jié)果提示我們miR-141可能在上皮性卵巢癌的卡鉑耐藥性中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，高表達的miR-141能夠增加上皮性卵巢癌對卡鉑耐藥性的產(chǎn)生，進而影響到患者5年生存率的高低。MiR-141作為miR-200家族的成員，在此家族成員與腫瘤干細胞的形成和EMT的調(diào)節(jié)有關(guān)[14-15]，我們的研究結(jié)果表明其可能在調(diào)控鉑類藥物敏感性方面發(fā)揮重要作用，為今后深入研究其調(diào)控作用的分子機制提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，上皮性卵巢癌組織中miR-141的表達情況與卡鉑敏感性和患者5年生存率存在顯著相關(guān)性，檢測皮性卵巢癌組織中miR-141的表達情況對預(yù)測上皮性卵巢癌對卡鉑治療敏感性、評估患者預(yù)后及提供合理的綜合治療措施具有重要的臨床意義，有可能成為逆轉(zhuǎn)耐藥的有效新靶點。

[1] Ledermann JA,Marth C,Carey MS,et al.Role of molecular agents and targeted therapy in clinical trials for women with ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2011,21(4):763-770.

[2] Bast RC Jr,Hennessy B,Mills GB.The biology of ovarian cancer:new opportunities for translation〔J〕.Nat Rev Cancer,2009,9(6):415-428.

[3] Ozols RF.Epithelial ovarian cancer〔A〕.In Hoskins WJY-R,Markman M,Perez CA,Barakat R,Randall M (eds).Principles and Practice of Gynaecologic Oncology〔C〕.Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins,2005.

[4] Ferlay J,Parkin DM,Steliarova-Foucher E.Estimates of ca-ncer incidence and mortality in Europe in 2008〔J〕.Eur J Cancer,2010,46(4):765-781.

[5] MTM van Jaarsveld,J Helleman,AWM Boersma,et al.miR-141 regulates KEAP1 and modulates cisplatin sensitivity in ovarian cancer cells〔J〕.Oncogene,2013,32(36):4284-4293.

[6] Scheithauer W,Clark G M,Salmon S E,et al.Model for estimation of clinically achievable plasma concentrations for investigational anticancer drugs in man〔J〕.Cancer Treat Rep,1986,70(12):1379-1382.

[7] McLellan LI,Wolf CR.Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance〔J〕.Drug Resist Updat,1999,2(3):153-164.

[8] Burger H,Loos WJ,Eechoute K,et al.Drug transporters of platinum-based anticancer agents and their clinical significance〔J〕.Drug Resist Updat,2011,14(1):22-34.

[9] Brozovic A,Osmak M.Activation of mitogen-activated protein kinases by cisplatin and their role in cisplatin-resistance〔J〕.Cancer Lett,2007,251(1):1-16.

[10] Martin LP,Hamilton TC,Schilder RJ.Platinum resistance:the role of DNA repair pathways〔J〕.Clin Cancer Res,2008,14(5):1291-1295.

[11] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets〔J〕.Cell,2005,120(1):15-20.

[12] Ye G,Fu G,Cui S,et al.MicroRNA 376c enhances ovarian cancer cell survival by targeting activin receptor-like kinase 7:implications for chemoresistance〔J〕.J Cell Sci,2011,124(pt3):359-368.

[13] Kong F,Sun C,Wang Z,et al.miR-125b confers resistance of ovarian cancer cells to cisplatin by targeting pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer 1〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2011,31(4):543-549.

[14] Park SM,Gaur AB,Lengyel E,et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2〔J〕.Genes Dev,2008,22(7):894-907.

[15] Wellner U,Schubert J,Burk UC,et al.The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs〔J〕.Nat Cell Biol,2009,11(12):1487-1495.