孕鼠暴露低劑量鄰苯二甲酸二己酯對仔鼠脂肪分布的影響

劉莉，劉慧敏，顧海倫，趙越，楊軍

(1.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 骨外科，遼寧 沈陽 110004)

鄰苯二甲酸酯是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，主要作為聚氯乙烯塑料的柔軟劑用于醫(yī)藥裝置、食品包裝、兒童玩具等[1]，為人群所廣泛接觸。關(guān)于其研究大多集中在生殖毒性、胚胎毒性等方面，而在脂肪分布方面的研究則較少。流行病學(xué)調(diào)查顯示，脂肪堆積的部位差異與慢性病的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。脂肪蓄積于臀、股部者罹患糖尿病、高脂血癥等慢性疾病的風(fēng)險較小，而脂肪過多蓄積于內(nèi)臟者則更傾向于罹患上述疾病。研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸酯暴露和腹部肥胖及胰島素抵抗之間存在聯(lián)系[2]，提示其可能對肥胖及脂肪分布產(chǎn)生影響。有證據(jù)顯示，脂肪儲存的部位特異性是每個儲存部位脂肪細胞特性的內(nèi)在差異[3]以及它們發(fā)育起源趨異的結(jié)果[4]。胚胎期鄰苯二甲酸酯的暴露可永久改變基因表達模式，影響代謝過程[5]。胚胎發(fā)育與模式特異性基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4(glypican 4，Gpc4)和Tbox-15(Tbx15)的表達具有部位特異性，在人和嚙齒類動物的體脂分布方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。因此，本研究擬以鄰苯二甲酸酯類中應(yīng)用最廣泛的一種物質(zhì)鄰苯二甲酸二己酯(di-2-ethylhexylphthalate，DEHP)為代表，通過喂飼C57BL/6J孕鼠含有低劑量的DEHP飼料，觀察其對仔鼠內(nèi)臟及皮下脂肪組織Gpc4、Tbx15mRNA表達的影響，為闡明脂肪分布的調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

實時熒光定量PCR儀(美國ABI PRISM7500)，高速臺式離心機(德國eppendorf centrifuge 5415D)，紫外可見分光光度計(德國Nanophotometer IMPLEN)，超低溫冰箱(美國THERMO SCIENTIFIC FORMA 994)。

1.2 試劑

DEHP(美國Sigma公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)，real-time RT-PCR試劑盒(TaKaRa大連寶生物公司)，引物(TaKaRa大連寶生物公司)，液相Erasol(四川天澤基因公司)。

1.3 動物分組

C57BL/6J小鼠(20只雌性，10只雄性)，清潔級，購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，動物合格證號SCXK(遼)2008-0005。晚8:00按雄雌鼠比例1∶2合籠，第2天早8:00觀察雌鼠陰栓產(chǎn)生情況，有陰栓者為懷孕第1天，將其分為2組。對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，DEHP組喂飼添加質(zhì)量分數(shù)為0.06% DEHP的基礎(chǔ)飼料，直至仔鼠出生。所有孕鼠均自由飲水，每周稱質(zhì)量。仔鼠出生后3周斷乳，喂飼基礎(chǔ)飼料，出生9周后，處死仔鼠，切取附睪周圍(作為內(nèi)臟脂肪組織的代表)和腹股溝處(作為皮下脂肪組織的代表)脂肪組織，稱質(zhì)量，凍存待測。

1.4 仔鼠附睪和皮下脂肪組織Gpc4、Tbx15 mRNA表達

采用real-time RT-PCR測定mRNA表達：TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為20 μl[包括5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligo dT(50 μmol·L-1)1 μl，Random 6 mers(100 μmol·L-1)1 μl，樣品RNA 500 ng，補足RNase Free dH2O至20 μl]；反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。real-time PCR根據(jù)說明書進行，總反應(yīng)體系20 μl[包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μl，上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6 μl];反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s 1個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，熔解反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。β-actin作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。Gpc4引物序列(169 bp)：上游5′-AGAGCAACGCCCAACCAC-3′，下游5′-GCCA TTCCAGCAGTCATC-3′；Tbx15引物序列(128 bp)：上游5′-AGCTTCTGGAGACACCTGGATGA-3′，下游5′-CGTGGACTCGAGGCTGGTATTTA-3′；β-actin引物序列(171 bp)：上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCA AC-3′，下游5′-ATGGAGCCACCGATC CACA-3′。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 孕鼠攝食、產(chǎn)仔情況

結(jié)果見表1。

表1兩組孕鼠的平均攝食量及產(chǎn)仔情況

Tab1TheaveragefoodintakeandlitterincontrolandDEHPgroup

組 別nDEHP暴露劑量/(mg·kg-1·d-1)平均攝食量/g產(chǎn)仔總數(shù)/只對照組306.414DEHP組31206.515

經(jīng)合籠后共有6只雌鼠懷孕，每組各3只，其余雌鼠棄用。DEHP組孕鼠喂飼含有質(zhì)量分數(shù)為0.06% DEHP的基礎(chǔ)飼料，根據(jù)其平均攝食量6.5 g計算，其平均DEHP暴露劑量為120 mg·(kg·d)-1。由表1可見，對照組和DEHP組孕鼠產(chǎn)仔情況基本相同，兩組孕鼠的平均攝食量無明顯差異。

2.2 仔鼠體質(zhì)量及脂肪分布情況

見表2。

表2兩組仔鼠出生9周后體質(zhì)量、皮下脂肪及附睪脂肪質(zhì)量

Tab2Thebodyweight，subtaneousandepididymaladiposetissuesweightofmice9weeksafterbirth

組 別n體質(zhì)量/g皮下脂肪/g附睪脂肪/g對照組1418.01±2.060.05±0.010.20±0.04DEHP組1518.18±2.250.04±0.010.28±0.02a

與對照組相比,aP<0.05

由表2可見，兩組小鼠體質(zhì)量和皮下脂肪質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DEHP組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 仔鼠附睪與皮下脂肪組織Gpc4 mRNA表達情況

兩組小鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA表達均顯著高于皮下脂肪(P<0.05)，DEHP組小鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA顯著高于對照組(P<0.01)，在皮下脂肪間無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

與對照組相比,aP<0.01;與皮下脂肪相比,bP<0.05

圖1仔鼠附睪與皮下脂肪組織Gpc4mRNA表達情況

Fig1TheexpressionofGpc4mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

2.4 仔鼠附睪與皮下脂肪組織Tbx15 mRNA表達情況

與皮下脂肪相比,aP<0.01;與對照組相比,bP<0.01

圖2仔鼠附睪與皮下脂肪組織Tbx15mRNA表達情況

Fig2TheexpressionofTbx15mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

由圖2可見，兩組小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表達均顯著高于附睪脂肪(P<0.01)，DEHP組小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.01)，在附睪脂肪間無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

近年來，肥胖相關(guān)的慢性病已經(jīng)成為危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，而脂肪蓄積部位的差異相比于肥胖本身更能影響慢性病的發(fā)病風(fēng)險[7]。有報道鄰苯二甲酸酯作為一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可能會影響脂肪組織的分布，而DEHP作為鄰苯二甲酸酯中應(yīng)用最廣泛的一種，受到更多的關(guān)注。據(jù)文獻報道，100 mg·kg-1·d-1劑量被認為低于可引起肝臟過氧化物酶體增殖的最低劑量[8]。本研究中孕鼠的DEHP暴露劑量為120 mg·kg-1·d-1，與文獻報道基本接近，結(jié)果顯示該暴露劑量不影響孕鼠的攝食量及產(chǎn)仔情況。

本研究結(jié)果顯示，兩組子代小鼠體質(zhì)量雖然相同，但DEHP組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)，說明在胚胎期暴露于一定劑量的DEHP可導(dǎo)致仔鼠脂肪易于向內(nèi)臟蓄積，影響脂肪組織的分布。DEHP通過何種機制影響脂肪組織的分布，目前還未見相關(guān)報道。有證據(jù)顯示，脂肪儲存的部位特異性是每個儲存部位脂肪細胞特性的內(nèi)在差異[3]以及它們發(fā)育起源趨異的結(jié)果[4]。Gpc4是硫酸乙酰肝素糖蛋白中Gpc家族的成員，在控制細胞生長、分化和形態(tài)形成方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Tbx15是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種胚胎發(fā)育及模式特異性基因與脂肪分布有關(guān)，內(nèi)臟脂肪組織低水平的Tbx15表達及皮下脂肪組織低水平的Gpc4表達與高腰臀比(腹部肥胖)強烈相關(guān)；而皮下脂肪組織高水平的Tbx15表達及內(nèi)臟脂肪組織高水平的Gpc4表達也與高腰臀比相聯(lián)系[6]。這提示內(nèi)臟和皮下脂肪組織Tbx15與Gpc4的表達與脂肪分布有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，給予孕鼠DEHP后，其仔鼠附睪脂肪Gpc4 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.01)，而皮下脂肪Tbx15 mRNA表達也顯著高于對照組(P<0.01)，說明母鼠在孕期接觸低劑量DEHP可引起仔鼠內(nèi)臟或皮下脂肪組織Gpc4和Tbx15表達改變，提示胚胎期低劑量DEHP暴露可能通過改變胚胎發(fā)育與模式特異性基因Gpc4和Tbx15的表達，影響脂肪組織的分布，使脂肪更傾向蓄積于內(nèi)臟。

DEHP具體通過何種機制影響了Gpc4和Tbx15的表達，目前還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸酯類可以誘導(dǎo)大鼠肝臟c-myc基因[9]以及雌激素受體α啟動子區(qū)[10]的低甲基化，改變其mRNA表達。因此，孕期DEHP暴露可能通過直接影響胚胎Tbx15的甲基化狀態(tài)而影響其mRNA表達。研究還發(fā)現(xiàn)，Gpc4啟動子活力高度依賴Sp3和Sp1的表達，在3T3-F442A細胞分化為脂肪細胞的過程中，Gpc4 mRNA的表達高低與Sp3蛋白、Sp3/Sp1的改變相一致，說明這兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達可能是控制脂肪細胞Gpc4表達的決定因素[11]。因此，DEHP可能通過影響Sp3和(或)Sp1表達而改變Gpc4表達。

綜上所述，本研究結(jié)果提示胚胎期DEHP的暴露可能通過改變內(nèi)臟及皮下Gpc4和Tbx15 mRNA的表達，影響脂肪組織的分布,其具體的調(diào)控機制還需進一步的探討。進一步的研究包括檢測Gpc4和Tbx15蛋白表達；建立仔鼠肥胖模型，觀察孕期接觸DEHP對子代肥胖發(fā)生情況及脂肪分布的影響；檢測Tbx15甲基化以及Sp3、Sp1表達情況等。

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