老年患者胃癌組織中CD44和ABCG2的表達(dá)及相關(guān)性

周 雨 易德保 蔣傳命 王 樂(lè) 凌 暉

(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，湖南 邵陽(yáng) 422000)

胃癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤〔1～3〕。干細(xì)胞標(biāo)志物(CD44)及ATP-結(jié)合盒亞家族成員2(ABCG2)是常用的研究腫瘤干細(xì)胞耐藥性的分子標(biāo)志物，在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌發(fā)生及分化有明顯關(guān)系。本研究觀察40例老年胃癌患者的胃癌組織中CD44和ABCG2蛋白的表達(dá)情況，并就兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析，從而了解CD44和ABCG2與胃癌發(fā)生及發(fā)展的聯(lián)系，最終為老年胃癌的早期診斷、治療效果評(píng)價(jià)、判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 老年胃腺癌組織40例來(lái)源于邵陽(yáng)市中心醫(yī)院及邵陽(yáng)醫(yī)專(zhuān)附屬醫(yī)院2008年1月至2009年12月的手術(shù)切除標(biāo)本。其中男28例，女12例，年齡56～78〔平均(64±7.3)〕歲，術(shù)前均未接受化療、放療等治療。

1.2試劑來(lái)源及試驗(yàn)方法 研究所用試劑包括兔抗CD44抗體、兔抗ABCG2抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、免疫組化(SP)試劑盒等，所有試劑均購(gòu)自Abcam公司及博士德公司。經(jīng)脫蠟水化及抗原修復(fù)后將切片置于3％H2O2中淹沒(méi)浸泡30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min 3次，使用10％正常山羊血清，中和非特異性反應(yīng)，濕盒內(nèi)放置20 min。滴加1∶1 000比例稀釋的CD44抗體及1∶200比例稀釋的ABCG2抗體于切片上，置濕盒內(nèi)，4℃冰箱過(guò)夜。取出，室溫下放置5 min，PBS洗3 min 3次，吸去水分，滴加二抗工作液，于濕盒內(nèi)37℃孵育25 min。溫度設(shè)置為37℃條件下，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，于濕盒內(nèi)孵育20 min，此切片后經(jīng)DAB底物顯色、蘇木素復(fù)染以及1％鹽酸酒精分化處理后，將切片置于顯微鏡下觀察及照相。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞及陰性細(xì)胞比率，分為 “-、+、、”4個(gè)等級(jí)，分別表示為陽(yáng)性細(xì)胞比率≤10％、 11％～40％、41％～70％、>70％。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株低分化黏液腺癌(MGC803)和中分化腺癌(SGC7901)為本室保存、低分化癌(AGS)購(gòu)自上海市中科院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層生長(zhǎng)，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶約80％～90％時(shí)傳代。傳代時(shí)常規(guī)吸去培養(yǎng)液，用含0.25％胰酶細(xì)胞消化液消化，在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即傾去胰酶細(xì)胞消化液，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，按所需濃度接種。

1.4Western印跡 二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。CD44、ABCG2表達(dá)檢測(cè)：細(xì)胞裂解，收集蛋白，變性后經(jīng)10％十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5％牛血清白蛋白的Tris鹽酸緩沖液(TBST)(Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L 含0.1％ Tween-20)封閉1 h，用CD44、ABCG2一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，5 min/次，相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CD44及ABCG2的表達(dá) CD44陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，主要位于細(xì)胞膜，ABCG2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性表達(dá)呈明顯的棕黃色顆粒。CD44蛋白在癌旁胃黏膜中的陽(yáng)性率為0，在慢性胃炎組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為18.75％(3/16)，在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率60％(24/40)。胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于慢性胃炎組織及癌旁組織(P<0.05)；ABCG2在慢性胃炎及癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為25％(4/16)和4.54％(1/22)，而在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)75％(30/40)顯著高于慢性胃炎組織及癌旁組織(P<0.05)。而癌旁胃黏膜ABCG2的陽(yáng)性表達(dá)率與慢性胃炎組織也存在顯著性差異(P<0.05)。ABCG2蛋白在不同分化程度癌細(xì)胞中的表達(dá)率均有明顯差異，ABCG2蛋白在不同分化程度腺癌中的表達(dá)率順序?yàn)榈头只?中分化>高分化，表達(dá)率分別為89.47％(17/19)、63.64％(7/11)、40％(4/10)，各組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 胃癌組織中CD44及ABCG2蛋白的表達(dá)(SP，×40)

表1胃腺癌、慢性胃炎和正常胃黏膜組織中ABCG2、CD44的表達(dá)(n)

與癌旁胃黏膜組比較：1)P<0.05；與慢性胃炎組比較：2)P<0.05

2.2CD44和ABCG2的相關(guān)性 ABCG2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的30例胃癌標(biāo)本中有20例(66.7％)CD44陽(yáng)性表達(dá)；高于ABCG2陰性標(biāo)本中CD44陽(yáng)性表達(dá)率〔2例(20％)〕。CD44與ABCG2蛋白之間呈正相關(guān)(r=0.94，P<0.05)。

2.3Western印跡結(jié)果 CD44和ABCG2蛋白在AGS、SGC7901、MGC803細(xì)胞中均有明顯表達(dá)，其中CD44蛋白在三株細(xì)胞中的光密度值分別為(0.81±0.05)、(0.82±0.04)、(0.84±0.06)，ABCG2蛋白在三株細(xì)胞中的光密度值分別是(0.75±0.04)、(0.76±0.03)、(0.78±0.06)；組間比較，三株細(xì)胞中的表達(dá)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

1:AGS細(xì)胞；2：SGC 7901細(xì)胞；3：MGC803細(xì)胞

3 討 論

胃癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)胃癌死亡率呈上升趨勢(shì)，多發(fā)人群年齡段為50～80歲〔4，5〕。胃癌生物學(xué)行為的相關(guān)研究是近年研究的熱點(diǎn)及亟待突破點(diǎn)。CD44及 ABCG2可能成為胃癌診斷和治療的標(biāo)志物。

CD44蛋白為細(xì)胞表面的組成成分，在許多腫瘤細(xì)胞表面都可表達(dá)，如肺癌、口腔癌、肝癌、大腸癌、宮頸癌等，其作用機(jī)理是通過(guò)直接或替代途徑增強(qiáng)了多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要物質(zhì)〔6，7〕。大量研究表明，CD44 可用于識(shí)別胃癌干細(xì)胞，CD44表達(dá)與胃癌的發(fā)生有明顯相關(guān)性。CD44可作為胃癌干細(xì)胞的標(biāo)志物應(yīng)用于對(duì)胃癌干細(xì)胞的識(shí)別，并且越來(lái)越多的研究指向CD44在腫瘤的浸潤(rùn)與發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。本研究說(shuō)明CD44參與胃癌變過(guò)程。本研究中發(fā)現(xiàn)，CD44不僅與胃癌發(fā)生過(guò)程有關(guān)聯(lián)，CD44蛋白的高表達(dá)也與腫瘤的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

ABCG2 在具備腫瘤干細(xì)胞特性的側(cè)群(SP)細(xì)胞中高表達(dá)，被認(rèn)為是分離 SP 表型細(xì)胞的重要標(biāo)志物〔8〕。SP 細(xì)胞的重要作用體現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及藥物耐受等方面。ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記目前受到廣泛關(guān)注。Wang等〔9，10〕在宮頸癌、胰腺癌、肝癌等細(xì)胞株中均成功分離出ABCG2為陽(yáng)性的細(xì)胞，其具有典型的干細(xì)胞特征。對(duì)ABCG2在胃癌中的表達(dá)研究，有助于發(fā)現(xiàn)胃癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記，從而顯著優(yōu)化胃癌的治療效果，同時(shí)能對(duì)研究胃癌的發(fā)生機(jī)制有著積極的促進(jìn)作用及重要意義。本研究結(jié)果說(shuō)明ABCG2參與胃癌的發(fā)生過(guò)程。ABCG2蛋白表達(dá)隨著分化程度逐漸降低呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。目前研究發(fā)現(xiàn)，大部分胃癌組織都為單獨(dú)表達(dá)CD44或ABCG2，但也有研究發(fā)現(xiàn)癌組織同時(shí)有CD44及ABCG2的升高。

綜上所述，CD44是胃癌干細(xì)胞的標(biāo)志物，在胃癌變過(guò)程中有表達(dá)升高現(xiàn)象，CD44可能參與胃癌的發(fā)生。其白作為SP 細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，ABCG2的表達(dá)與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展中ABCG2和CD44可能起到一定的協(xié)同作用，針對(duì)兩者關(guān)系進(jìn)行全面檢測(cè)具有重要意義，一方面對(duì)于胃癌早期診斷，ABCG2和CD44是重要的檢測(cè)指標(biāo)；另一方面對(duì)于胃癌治療效果，ABCG2和CD44的表達(dá)可以作為重要的評(píng)判依據(jù)。

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