房顫大鼠心房肌組織結(jié)構(gòu)及KV1.5蛋白和 mRNA表達(dá)的變化

丁紹祥 柳 茵 劉維軍 李 琳

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810000)

心房顫動(AF)是最常見的持續(xù)性室上性心律失常，隨年齡增大其發(fā)病率逐漸增加〔1〕。目前我國人群的平均患病率為0.77％，隨老年人口數(shù)量的增多，患病率有增加的趨勢〔2〕。AF時不僅有心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，也有心肌電重構(gòu)，因此，研究AF時心房肌細(xì)胞膜上離子通道的改變對揭示AF的發(fā)生機制及治療無疑有重要意義〔3〕。超速延遲整流鉀通道(Kur)在人類僅存在于心房肌，是重要的復(fù)極電流〔4〕。它在-30 mV時激活，激活時間常數(shù)為2～18 ms(25℃)，快通道開放時間約50 ms，因此，主要作用在心房肌細(xì)胞平臺期，使2相動作電位時程(APD)縮短，并縮短心房有效不應(yīng)期(AERP)。然而，在人類慢性AF研究中發(fā)現(xiàn)IKur明顯減少，由其所致的動作電位時程的延長無法終止心AF動，引起人們對AF治療的思考〔5〕。大鼠AF時IKur蛋白密度改變目前意見尚不一致，其改變是促進AF抑或抑制AF尚未見相關(guān)明確報道。在目前 “AF促AF”的理論中，心房肌細(xì)胞膜離子通道電重構(gòu)的表達(dá)尚存在較大爭議。大鼠AF時IKur的改變及心房結(jié)構(gòu)的改變以及二者之間的關(guān)系將有助于人們對AF發(fā)病機制的認(rèn)識，并促進人們對AF發(fā)病機制的進一步研究。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2008-0012；引物合成(上海捷瑞：KV1.5-正義鏈5'-GCTTCATCAAGGAAGAGGAGAA-3',KV1.5-反義鏈5'-CACGAGCAACTCAAAAGTGAA C-3',371 bp；β-actin-正義鏈 5'-CGTGCGTGACATTAAAGAGAAG-3',β-actin-反義鏈5'-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3',262 bp)；RT-PCR試劑盒(北京天根)；KV1.5多克隆抗體(一抗，山羊抗鼠，美國Santa Cruz)；兔抗山羊多克隆抗體(二抗，北京中杉金橋)；生物心電圖記錄儀(澳大利亞ML818)；生物組織自動脫水機(湖北亞光ZT-12P)；PCR擴增儀(德國 Biometra)；石蠟包埋機(德國LEICA EG1150H)；IMAGE-PRO plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics)；Quantity one v4.62 software(Bio-Rad 圖像分析軟件)。實驗次日因麻醉意外致對照組雄1號和雌4號死亡；AF組雄性大鼠12號于實驗第6天尾靜脈注射藥物后數(shù)分鐘內(nèi)死亡。

1.2方法

1.2.1AF大鼠造模 用20％烏拉坦按0.8 ml/100 g體重腹腔注射進行麻醉，行心電圖檢查并記錄。實驗組按0.1 ml/100 g體重于尾靜脈注射混合藥物(CaCl210 mg/ml，Ach 66 μg/ml)，1次/d，共1 w。1 w后用相同的方法對所有大鼠進行麻醉后注射藥物，同時分別再次行心電圖檢查并記錄；對照組按同樣的方法和劑量注射生理鹽水并按同樣的方法行心電圖檢查并記錄。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 1 w后處死大鼠，取適量左心房組織提取總RNA后用紫外光分光光度計測定其含量和純度并行電泳質(zhì)量檢測。嚴(yán)格按說明操作；剩余心房組織備制切片及免疫組化分析。合成cDNA后用已設(shè)計的引物擴增相應(yīng)目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段并繪好區(qū)帶電泳圖，使用Bio-Rad圖像分析軟件，對目的基因和內(nèi)參基因的擴增條帶進行灰度掃描所得灰度值(即光強度)，減去所定義的背景灰度值，得到各條帶的灰度值，再經(jīng)內(nèi)參矯正后，得一相對比值，記錄后用統(tǒng)計學(xué)軟件處理。

1.2.3病理切片和免疫組化 從20％甲醛浸泡液中取小塊心房組織，置全自動脫水機自動處理后行石蠟包埋，將蠟包埋的心房肌組織按3 μm厚度切片，每一標(biāo)本組織切6片，行免疫組化染色及病理切片制作。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1心電圖檢查結(jié)果 對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水前后心電圖無明顯變化：P波明顯，基線穩(wěn)定，R-R間期勻齊(見圖1)。實驗組大鼠于尾靜脈注射藥物后即刻出現(xiàn)房顫：P波消失，出現(xiàn)形態(tài)大小不一的小“f”波，R-R間期不等(見圖2)。

圖1 正常大鼠心電圖

圖2 大鼠AF時心電圖

2.2大鼠心房肌組織KV1.5 mRNA表達(dá) 對照組：0.848±0.036；AF組：0.613±0.040。兩組差異顯著(t=13.777,P<0.01)。

2.3大鼠心房肌組織KV1.5蛋白表達(dá) 所有免疫組化切片平均光密度值，對照組：0.110 9±0.003 3，AF組：0.090 5±0.004 8。兩組差異顯著(t=10.626，P<0.01)。

2.4大鼠心房組織切片染色結(jié)果 對照組大鼠心房組織標(biāo)本切片鏡檢顯示:心外膜不厚，心肌纖維清晰，無肌凝、肌溶，心肌細(xì)胞間質(zhì)間隙略增寬，心內(nèi)膜未見異常。AF大鼠心房組織標(biāo)本切片鏡檢顯示:心肌出現(xiàn)不同程度的心肌斷裂、肌溶、細(xì)胞肥大、炎性細(xì)胞浸潤、灶性壞死、纖維組織增生等病理性改變。見圖3。

對照組

AF組

3 討 論

近年來，人們認(rèn)識到心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是AF發(fā)生和維持的重要基礎(chǔ)〔6〕。前者是指與生理條件比較，相應(yīng)離子通道的數(shù)目表現(xiàn)為上調(diào)或下降，而離子通道的結(jié)構(gòu)和功能并不發(fā)生明顯的改變；后者是指心肌間質(zhì)組織增生或纖維化增多，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，部分細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)、形態(tài)及數(shù)量出現(xiàn)改變。AF時，心房肌離子通道出現(xiàn)電重構(gòu)，使心房肌動作電位時程縮短，興奮頻率增加，但各離子通道在此過程中的變化并不一致〔7〕。在目前AF的發(fā)病機制尚未完全明確的情況下，各離子通道的變化與AF發(fā)生及維持的關(guān)系無疑是研究的重點〔8〕。

本實驗大鼠AF模型，其電生理學(xué)的病理變化與臨床AF相似，適用于化合物抗AF活性篩選研究〔9〕。實驗發(fā)現(xiàn)，AF組大鼠KV1.5 mRNA及相應(yīng)蛋白的表達(dá)均較對照組減低，且有統(tǒng)計學(xué)意義，提示AF時其表達(dá)下調(diào)延長心房肌APD。同樣，在人類慢性AF研究時發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)明顯下降，延長AERP〔10〕，說明這種變化是抑制AF折返形成。而心房肌1相離子流Ito和主要2相離子流IKr、IKs于慢性AF時也明顯下降，使AERP延長，均不利于AF折返的形成〔11〕；IK1、IKAch主要在3相,對AF的發(fā)生和維持有雙重作用：它雖能縮短心肌動作電位時程，但也同時增大心肌的舒張電位，使心肌的興奮性減低，也不利于AF的形成。因此，AF時心房電重構(gòu)是抑制AF的形成抑或促進AF的形成尚需進一步研究。而從AF時各離子通道總體變化分析，各離子通道的變化可能并非為適應(yīng)AF而改變，相反，更可能是機體的一種代償機制以抑制AF形成，只是抑制心律失常在某種程度上也能導(dǎo)致心律失常，它取決于臟器受累的病變程度及機體自身的代償范圍。

臟器結(jié)構(gòu)決定并反映其功能，臟器功能雖能誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)改變，但受制于臟器的結(jié)構(gòu)特征，因此，AF時心房肌電重構(gòu)是繼發(fā)于心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)〔12〕。本實驗中，AF大鼠心房肌組織均出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而對存在較多移行區(qū)域的心肌組織，其結(jié)構(gòu)重構(gòu)無疑將進一步加重心房除復(fù)極的非同步性，誘導(dǎo)心肌電紊亂〔13〕。研究表明，慢性AF也多合并心臟器質(zhì)性病變〔14〕。

AF本身是心房肌心肌電的紊亂，若其心肌電重構(gòu)是促進AF形成，也就是說，AF時心肌電紊亂促進心肌電進一步紊亂以適應(yīng)AF，則從AF發(fā)生起，在沒有外界因素干預(yù)下，AF不可能自行停止，這相當(dāng)于機體的正反饋機制。而AF電重構(gòu)是可逆的〔15〕，說明這種心肌電自身促進機制本身就與事實不太相符。與實驗現(xiàn)象最可能的解釋是：人工誘發(fā)的AF造成心房肌組織損傷，損傷的心房肌組織利于AF的發(fā)生和維持，這也是動物AF造模時多次反復(fù)予以刺激后AF易于發(fā)生并趨于穩(wěn)定的原因所在，本文實驗也不例外：即心肌電紊亂是繼發(fā)于人工刺激或心房肌組織損傷后的改變，AF的逆轉(zhuǎn)與心房的被動刺激消除和心房肌受損的可逆性有關(guān)。因此，AF促AF的本質(zhì)是心房肌心肌電紊亂誘發(fā)AF所啟動的損傷因素進一步加重心房組織結(jié)構(gòu)的損傷，若機體不能逆轉(zhuǎn)其損傷效應(yīng)，則減低心房自身代償儲備功能，反復(fù)發(fā)作致結(jié)構(gòu)重構(gòu)；心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)又誘導(dǎo)心肌電的紊亂，導(dǎo)致持續(xù)性或永久性AF。因此，AF促AF只是其結(jié)構(gòu)重構(gòu)促進AF的發(fā)生和維持，而心肌電重構(gòu)更多的是抑制AF、回歸生理功能的需求。

因本研究均為半定量表達(dá)，反映相應(yīng)指標(biāo)的總體趨勢，難免有不足，需更為精確實驗檢測。

4 參考文獻

1Olesen JB,Lip GY,Lane DA.An epidemic of atrial fibrillation〔J〕? Europace,2011；3(8):1059-60.

2黃從新,張 澍,馬長生,等.心房顫動:目前的認(rèn)識和治療建議—2012〔J〕.中華心律失常學(xué)雜志,2012；6(4)：346-89.

3Camm AJ,Al-Khatib SM,Calkins H,etal.A proposal for new clinical concepts in the management of atrial fibrillation〔J〕.Am Heart J，2012；164(3)：292-302.

4Ravens U,Wettwer E.Ultra-rapid delayed rectifier channels:molecular basis and therapeutic implications〔J〕.Cardiovasc Res,2011；89(4):776- 85.

5Almquist J,Wallman M,Jacobson I,etal.Modeling the effect of Kv1.5 block on the canine action potential〔J〕.Biophys J,2010；99(9):2726-36.

6Xu Y,Sharma D,Li G,etal.Atrial remodeling:new pathophysiological mechanism of atrial fibrillation〔J〕.Med Hypotheses,2013；80(1):53-6.

7Caballero R,de la Fuente MG,Gómez R,etal.In humans，chronic atrial fibrillation decreases the transient outward current and ultrarapid component of the delayed rectifier current differentially on each atria and increases the slow component of the delayed rectifier current in both〔J〕.Am Coll Cardiol,2010；55(21):2346-54.

8Grunnet M,Bentzen BH Sorensen US,etal.Cardiac ion channels and mechanisms for protection against atrial fibrillation〔J〕.Rev Physiol Biochem Pharmacol,2012；(162):1-58.

9陳春林,鞏甜甜,湯依群,等.SD大鼠房顫模型的建立〔J〕.動物實驗科學(xué),2009；26(3):1-4.

10Nattel S,Maguy A,Le Bouter S,etal. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart：heart failure，myocardial infarction，and atrial fibrillation〔J〕.Physiol Rev，2007；87(2)：425- 6.

11Oh S,Kim KB,Ahn H,etal.Remodeling of ion channel expression in patients with chronic atrial fibrillation and mitral valvular heart disease〔J〕.Korean J Intern Med,2010；25(4):377-85.

12Chimenti C,Russo MA,Carpi A,etal.Histological substrate of human atrial fibrillation〔J〕.Biomed Pharmacother,2010；64(3):177-83.

13丁紹祥.J波和2相折返形成離子流機制研究進展〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2012；32(12):2676-8.

14Lardizabal JA,Deedwania PC.Atrial fibrillation in heart failure〔J〕.Med Clin North Am，2012；96(5)：987-1000.

15Pang H,Ronderos R,Pérez-Riera AR,etal.Reverse atrial electrical remodeling:a systematic review〔J〕.Cardiol J,2011；18(6):625-31.