Aβ25～35對大鼠海馬神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞的影響

王愛霞 董雅潔 狄婷婷 申興斌 王瑞婷

(承德醫(yī)學院，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)的老年斑由β淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積形成〔1〕，繼而誘發(fā)廣泛的炎癥反應，近幾年的研究顯示炎癥反應在AD中的作用越來越受到關(guān)注。小膠質(zhì)細胞(MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應細胞，在機體固有免疫和多種神經(jīng)退行性疾病的炎癥反應中發(fā)揮重要作用，MG在AD發(fā)生中的作用是目前AD研究的熱點之一〔2〕。有研究報道Aβ斑塊沉積與神經(jīng)元損傷和MG的功能密切相關(guān)，但注射Aβ后不同時間點Aβ25～35對大鼠海馬神經(jīng)元及MG的影響未見報道。本研究分析Aβ對大鼠海馬神經(jīng)元的影響及與MG變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1動物 雄性Wistar大鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量(260±20)g，SPF級，批號：0289310，由北京華阜康生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：scxk京2009-0004。實驗動物在SPF實驗室〔No.SYXK (冀) 2009-0022〕飼養(yǎng)，自然光線，自由食水。

1.2試劑 Aβ25～35(Lot：111M4775V)，由Sigma公司提供，Aβ25～351 mg溶于500 μl無菌生理鹽水(2 g/L)，-20℃保存，臨用前置于37℃孵育3～5 d成凝聚態(tài)，cd11b抗體(Lot：Y-07D10A)，即用型SABC試劑盒(Lot：08A22C)及DAB顯色試劑盒(Lot：08A04A22)由武漢博士德生物工程有限公司提供；Aβ25～35抗體(Lot：980287W)由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.3儀器 江灣Ⅰ型C腦立體定位儀，上海第二軍醫(yī)大學；Morris大鼠水迷宮，中國醫(yī)學科學院藥物研究所。

1.4實驗分組及處理 實驗分為正常對照組和模型組(4個時間點)，每組8只，適應性飼養(yǎng)1 w。第8天正常對照組雙側(cè)海馬各注射無菌生理鹽水5 μl，模型組雙側(cè)海馬CA1區(qū)各注射凝聚態(tài)Aβ25～355 μl(10 μg)。模型組按照注射Aβ25～35后不同時間2、7、15、21 d處死分為四組。對照組及15 d、21 d模型組三組在注射Aβ 7 d后進行水迷宮實驗。

1.5制作AD動物模型方法 適應性飼養(yǎng)1 w后，第8天用4％水合氯醛(10 ml/kg，ip)麻醉大鼠，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上，調(diào)節(jié)固定平面使門齒比內(nèi)耳連線中點低2 mm，清潔皮膚做正中豎切口，剝開皮下筋膜暴露頂骨，在兩側(cè)冠狀縫后鉆出小孔，保持硬腦膜的完整。海馬區(qū)定位坐標：前囟后AP -3.5 mm，中線外側(cè)ML ±2.0 mm，前囟水平下DV 2.7 mm。雙側(cè)用微量注射器分別注入5 μl Aβ25～35凝聚肽10 min內(nèi)注完，注射后留針5 min。正常對照組注射同體積生理鹽水。

1.6Morris水迷宮行為學實驗 Morris水迷宮由圓形水池、自動攝像機和電腦操作系統(tǒng)三部分組成。圓形水池直徑120 cm，高60 cm，將水池等分為4個象限，目標象限的中央放置一直徑為10 cm的圓形有機玻璃平臺。水池注水至水面高于平臺1.5 cm，維持水溫(21±1)℃，倒入黑色墨汁一瓶，攪勻，確保大鼠不會看見平臺；實驗期間迷宮周圍參照物不變，自動攝像機同步記錄大鼠運動軌跡。于注射Aβ 7 d后開始實驗，第1～2天為訓練，第3～5天數(shù)據(jù)作為學習、記憶成績，第6天撤去平臺，觀察大鼠2 min內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)。

1.7標本制備 動物麻醉后，經(jīng)左心室快速灌注250 ml的生理鹽水，然后灌注含4％多聚甲醛的PBS液250 ml進行固定，1 h后取腦，左右半腦各在海馬注射部位沿冠狀切面切開，對組織塊進行修剪，4％多聚甲醛固定過夜，PBS液洗去多聚甲醛，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，將兩塊組織的切面朝下包埋，行冠狀切片，片厚5 μm，切片取含海馬部位，以備染色。

1.8腦組織硫堇染色和神經(jīng)元計數(shù) 二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，蒸餾水沖洗，0.2％硫堇染色，37℃水浴10～15 min(防過染)。取出切片冷水沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后光學顯微鏡觀察。每組選取3個標本，光鏡下每個標本選海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷最嚴重的連續(xù)3張切片，選取9個不重復視野在400倍視野下計數(shù)CA1區(qū)損傷段的神經(jīng)元數(shù)。

1.9Aβ及CD11b免疫組化檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3％H2O2在37℃恒溫箱孵育30 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS洗3次，微波抗原修復(低火4 min，中低火4 min)，冷卻30 min，PBS洗3次，5％BSA封閉30 min。選取的切片加1∶100 CD11b抗體檢測MG，另選取的切片加1∶100 Aβ25～35抗體檢測Aβ沉積部位，4℃過夜。第2天37℃孵育45 min，PBS洗3次，生物素化山羊抗兔IgG 37℃孵育45 min，PBS洗3次，SABC 37℃孵育45 min，PBS洗3次，DAB顯色，光鏡下觀察陽性顯色為棕黃色，用蒸餾水沖洗10 min終止反應。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片后光學顯微鏡進行觀察。

1.10免疫組化結(jié)果觀察 每組選取3只大鼠海馬標本，光鏡下每個標本選海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷最嚴重的連續(xù)3張切片，共選取9個不重復視野在400倍視野下采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測量每組切片的平均光密度值(IOD)，用于定量分析免疫組化陽性反應程度。

2 結(jié) 果

2.1Aβ對大鼠水迷宮實驗的影響 與對照組相比，模型組15 d和21 d大鼠尋找平臺的平均潛伏期明顯延長(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。表明海馬注射Aβ25～35能影響大鼠的空間探索和學習記憶能力。見表1。

表1 各組大鼠尋找平臺的平均潛伏期和各組大鼠穿越平臺的次數(shù)

2.2Aβ對大鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的影響 對照組大鼠海馬CA1區(qū)細胞帶完整，排列整齊有序，神經(jīng)元形態(tài)正常，胞核不著色，胞質(zhì)尼氏體著色深，未見神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)細胞增生。模型組2 d大鼠海馬CA1區(qū)較對照組大鼠神經(jīng)元明顯減少，細胞排列紊亂、腫脹、著色淺；模型組7 d大鼠海馬CA1區(qū)較對照組大鼠神經(jīng)元明顯減少，排列紊亂、腫脹，尼氏體溶解；模型組15 d較對照組神經(jīng)元明顯減少，排列紊亂，胞體縮小，細胞核固縮，尼氏體消失，膠質(zhì)細胞增生明顯；模型組21 d神經(jīng)元排列紊亂分散，但神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有改善趨勢。從注射Aβ 2～7 d、15 d神經(jīng)元損傷逐漸加重，膠質(zhì)細胞增多，至21 d，神經(jīng)元損傷較15 d有緩和現(xiàn)象，膠質(zhì)細胞減少。見圖1，表2。

2.3海馬CA1區(qū)Aβ25～35表達水平的比較 鏡下可見Aβ陽性表達為棕黃色顆粒物，分布在神經(jīng)細胞外和小膠質(zhì)細胞質(zhì)。各組Aβ陽性表達變化：對照組Aβ陽性表達極低；2 d組Aβ免疫組化著色局部明顯加重，陽性表達較對照組顯著增多(P<0.05)；與2 d組相比，7 d組Aβ免疫組化著色均勻，陽性表達相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與2 d組相比，15 d組Aβ免疫組化著色較淺，陽性表達顯著減少(P<0.05)；與2 d組相比，21 d組Aβ陽性表達顯著減少(P<0.05)。Aβ免疫組化顯示模型組大鼠Aβ沉積量在2～7 d穩(wěn)定并達最高值，之后呈下降趨勢。見圖2，表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)、Aβ25～35及CD11b表達水平的比較

圖1 海馬硫堇染色

2.4海馬CA1區(qū)MG的變化 CD11b為MG的特異性表面標志物，主要表達在活化的MG胞質(zhì)。免疫組化顯示MG胞質(zhì)呈棕黃色，包繞在神經(jīng)元周圍。對照組CD11b陽性表達率極低，MG呈桿狀；2 d和7 d組CD11b陽性率高，但形態(tài)相互差別大，2 d組MG形態(tài)有的呈分支狀，突起粗短，有的胞體呈橢圓，而7 d組MG胞體呈橢圓，阿米巴樣，聚集在神經(jīng)元周圍，吞噬清除變性的神經(jīng)元及細胞碎片；15 d組CD11b陽性表達減弱，MG胞體呈圓形或延長，伸出一個或多個突起，聚集在神經(jīng)細胞周圍；21 d組CD11b陽性率低，MG的胞體呈橢圓，無突起，分布散落。與對照組相比，模型組4個時間點MG的形態(tài)和活化量都有顯著差異(P<0.05)，模型組2 d和7 dMG活化量無顯著差異(P>0.05)，但其后MG活化量隨時間延長呈下降趨勢。MG分布部位與Aβ沉積部位相似。見圖3，表2。

圖2海馬Aβ免疫組化染色(×400)

圖3海馬CD11b免疫組化染色(×400)

3 討 論

Aβ在海馬和大腦皮質(zhì)的細胞外沉積形成老年斑〔3〕，是AD的主要病理特征之一。目前很多學者認可β淀粉樣蛋白級聯(lián)學說〔4〕，認為Aβ在腦內(nèi)產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡失調(diào)，聚集態(tài)Aβ累積誘發(fā)的氧化應激〔5〕、細胞凋亡〔6〕、炎癥反應〔7〕、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)〔8〕等促使AD發(fā)生發(fā)展。Aβ由39～43個氨基酸組成，證實引起毒性主要部位在第25～35氨基酸之間(Aβ25～35)〔9，10〕，因此本實驗采用大鼠雙側(cè)海馬注射凝聚態(tài)Aβ25～35建立AD大鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射Aβ后4個時間點大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有不同程度的損傷，15 d、21 d組大鼠學習記憶能力下降，證實凝聚態(tài)Aβ25～35對神經(jīng)元的毒性作用〔11，12〕，Aβ可以引起神經(jīng)元損傷。

Aβ神經(jīng)毒性作用被認為是多因素導致AD的共同通路。注射Aβ后，從第2～15天，海馬神經(jīng)元損傷逐漸加重，從15～21 d趨于穩(wěn)定和修復，推測一次注射一定量Aβ后通過某些途徑引起神經(jīng)元損傷，但隨著Aβ被降解、清除，體內(nèi)內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定、平衡，神經(jīng)元損傷也趨于穩(wěn)定和修復。結(jié)合Aβ、CD11b免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Aβ沉積在神經(jīng)元周圍，活化的MG增多，Aβ沉積部位與MG分布部位相似，沉積量呈遞減趨勢，MG胞漿內(nèi)有Aβ沉積，以上結(jié)果提示沉積在神經(jīng)元周圍的Aβ可募集并激活MG，MG可吞噬Aβ并降解Aβ。Aβ沉積在第2～7天穩(wěn)定在高水平，之后呈遞減趨勢，MG活化在第7天達高峰，之后隨著Aβ被吞噬、降解，活化的MG也呈減少趨勢，Aβ沉積量與MG活化具有相關(guān)性，即Aβ沉積越多，被活化的MG越多，活化的MG清除Aβ，Aβ沉積減少，活化的MG減少。MG通過清除Aβ可以一定程度上減輕Aβ沉積引起的神經(jīng)元損傷，但不能完全阻斷Aβ已觸發(fā)的級聯(lián)式的反應所引起的損傷，如啟動的神經(jīng)元凋亡〔13〕。因此，盡管在第7天MG活化最多，神經(jīng)元損傷仍在進行，到第15天最嚴重。Simard等〔14，15〕研究也發(fā)現(xiàn)MG可以吞噬Aβ，限制老年斑形成，分泌降解Aβ的蛋白水解酶，對神經(jīng)元有保護作用。有研究證實轉(zhuǎn)基因小鼠MG功能失調(diào)，結(jié)合Aβ的受體和降解Aβ酶的表達顯著減少，導致Aβ沉積的量增加，Aβ斑塊沉積和MG的功能密切相關(guān)〔16～18〕。Cramer等〔19〕認為Aβ的沉積量減少，MG吞噬功能增強，可促使神經(jīng)功能改善。本實驗發(fā)現(xiàn)在第21天，Aβ沉積量減至最少，神經(jīng)元損傷趨于穩(wěn)定和修復。

MG作為中樞常駐的免疫細胞，巨噬細胞在機體固有免疫和多種神經(jīng)退行性疾病的炎癥反應中具有重要作用〔20〕。有研究發(fā)現(xiàn)在AD病程中，MG被吸引到Aβ斑塊周圍，產(chǎn)生炎性細胞因子引起損傷〔21，22〕。Liu等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中激活的MG顯著高于正常對照組，并伴有大量神經(jīng)元凋亡，Weinstock等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)膽堿酯酶抑制劑ladostigil 減輕衰老大鼠認知功能降低的作用與CD11b表達減少有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)不同時間點AD模型大鼠海馬CA1區(qū)活化的MG數(shù)量明顯高于對照組，同時伴有神經(jīng)元損傷，提示MG的激活與AD的病理進程有關(guān)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)模型15 d組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量較對照組增多，提示活化的MG可能分泌炎癥因子，對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。

活化的MG清除、吞噬Aβ保護神經(jīng)元與其可能釋放炎癥因子引起神經(jīng)元損傷的雙相作用一致是AD研究的熱點之一。本實驗發(fā)現(xiàn)不同時間點活化的MG形態(tài)各異，可能不同形態(tài)的MG吞噬功能不盡相同。進一步探討MG吞噬功能、損傷作用、不同劑量Aβ刺激下MG上相關(guān)受體、酶、因子的變化與神經(jīng)元損傷的關(guān)系，從中尋找靶點增強或抑制表達，可為AD治療提供新的思路。

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