miR27a對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

何培生 唐 穎 周小平 芮曉云 周紅梅

(重慶三峽中心醫(yī)院普外二科，重慶 404000)

大量的研究證明miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、治療和預(yù)后等過程，具有重要的生物學(xué)功能〔1～3〕。也有文獻(xiàn)〔4～6〕報道很多miRNA與結(jié)腸癌有關(guān)，如miR143和miR145等，但miR196a、miR146a、miR27a和miR200a等在結(jié)腸癌中的作用卻未見報道。本研究檢測miR196a、miR146a、miR27a和miR200a在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，并探討其中差異miRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FCS)、青霉素-鏈霉素(P-S雙抗)等均購自美國GIBCO公司，使用前按照89∶10∶1比例配制成完全1640培養(yǎng)液； mRNA抽提試劑盒miRNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverAidTM First Strand Cdna Synthesis Kit購自Thermo公司；RT-PCR試劑盒FastvStart Universal SYBR Green Master Kit購自羅氏公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine2000(簡稱lipo2000)購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購自碧云天生物技術(shù)研究所；miR27a mimics和miR27a inhibitors及陰性控制購自廣州銳博公司(RiBoBio)；Matrigel購自BD Bioscience公司；Transwell侵襲小室(8 pm孔徑)購自Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司。

1.2方法

1.2.1病例樣本和體外實驗樣本量 正常組為33例健康志愿者的結(jié)腸組織，大腸炎組為26例結(jié)腸炎患者的炎性結(jié)腸組織，結(jié)腸癌組為42例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織；體外實驗每組樣本量n≥6，每個實驗重復(fù)3次。

1.2.2RT-PCR 提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取各組cDNA，用ddH2O稀釋50倍。設(shè)定以下循環(huán)：①50℃，2 min；②95℃，10 min；③95℃，15 s；④60℃，1 min；⑤重復(fù)第③④步；⑥95℃，15 s；⑦60℃，30 s；⑧95℃，15 s。上樣檢測。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 用含10％ FCS的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37℃、無CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗分組 (1)對照組，無任何轉(zhuǎn)染；(2)脂質(zhì)體組，僅加入脂質(zhì)體；(3)Negative組，加入無關(guān)序列和脂質(zhì)體；(4)miR27a mimics轉(zhuǎn)染組，加入miR27a mimics 80 nmol/L(終濃度為100 nmol/L)和相應(yīng)劑量的脂質(zhì)體；(5) miR27a inhibitors轉(zhuǎn)染組，加入miR27a inhibitors 80 nmol/L(終濃度為80 nmol/L)和相應(yīng)劑量的脂質(zhì)體。

1.2.5轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前24 h接種結(jié)腸癌細(xì)胞于24孔板，待生長至30％～50％匯合時，0pti-MEM I 釋轉(zhuǎn)染試劑lipo2000，另用Opti-MEM I 分別稀釋不同劑量的Transfection Control(Cy3)，使轉(zhuǎn)染時終濃度分別為40、60、80、100和120 nmol/L，室溫孵育5 min；二者混合，室溫培養(yǎng)20 min以形成Transfection Control(Cy3)-lipo2000混合物，再加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的24孔板中，輕晃均勻；將培養(yǎng)板置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用PCR檢測miR27a的表達(dá)情況，以確定最優(yōu)轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.6miR27a mimics和miR27a inhibitors轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h接種結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo于6孔板，待生長至30％～50％匯合時，取Negative、miR27a mimics、miR27a inhibitors和脂質(zhì)體，分別經(jīng)Opti-MEM稀釋。于室溫中作用5 min后將兩者緩緩混合，靜置20 min，加入結(jié)腸癌細(xì)胞中搖晃混勻。培養(yǎng)6 h后換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。另設(shè)單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對照組。實驗重復(fù)3次。

1.2.7CCK-8檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力 按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行。將結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo按4×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)中，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后(24、48、72 h)加入CCK-8 10 μl/L，37℃、5％ CO2培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定D450值。每個處理組設(shè)5個復(fù)孔。重復(fù)3次。

1.2.8侵襲能力檢測 結(jié)腸癌細(xì)胞體外侵襲實驗：用50 mg/L基質(zhì)膠(BD公司)1∶4稀釋液包被8/μm孔徑Transwell小室濾膜的上表面，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中溫育1 h，用L-15水化小室濾膜上、下表面。消化收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1～2遍，用含0.1％BSA的L-15培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml的細(xì)胞懸液。24孔板中放置Transwell侵襲小室，先在小室上層分別加入事先制備好的4組細(xì)胞懸液200 μl，輕輕搖勻。再向下室加入600 μl含10％FBS的L-15培養(yǎng)液。置24孔板于37℃、無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后從孔板中移出小室，用脫脂棉拭去小室濾膜上層未通過微孔的細(xì)胞，將此濾膜先于4％多聚甲醛中固定30 min，1％結(jié)晶紫染色10 min，使侵襲到濾膜下層的細(xì)胞充分著色呈紫藍(lán)色，輕輕洗滌殘余染料，倒置顯微鏡觀察，每組隨機(jī)選擇6個視野，計數(shù)。重復(fù)實驗3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS17.0 軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌癌組織中miR196a、miR146a、miR27a和miR200a的表達(dá)水平 與正常組相比，結(jié)腸炎組和結(jié)腸癌組中miR196a的表達(dá)基本沒有變化；正常組和結(jié)腸炎組miR146a的表達(dá)也沒有差異，而結(jié)腸癌組miR146a的表達(dá)水平則比正常組略有增高，但是并沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；同樣，結(jié)腸炎組中miR27a的表達(dá)與正常組一致，但結(jié)腸癌組miR27a的表達(dá)水平與正常組和大腸炎組相比顯著增加(P<0.05)；miR200a在結(jié)腸炎組和結(jié)腸癌組中的表達(dá)水平比正常組均略有增高，但仍沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌癌組織中miR196a、miR146a、miR27a和miR200a的表達(dá)水平

2.2轉(zhuǎn)染效率 miR27a mimics轉(zhuǎn)染組隨著轉(zhuǎn)染劑量的不斷增加，檢測到的胞內(nèi)miR27a水平也逐漸增多，終濃度為80 nmol/L時，miR27a的水平達(dá)到高峰，之后終濃度增至100和120 nmol/L時，miR27a的水平則進(jìn)入平臺期，不再增加(圖2A)；miR27a inhibitors轉(zhuǎn)染組隨轉(zhuǎn)染劑量的增加，胞內(nèi)miR27a水平逐漸下降，當(dāng)終濃度為100 nmol/L時，miR27a inhibitors的水平降至最低，濃度增加為120 nmol/L時，miR27a inhibitors的水平并無明顯下降，進(jìn)入平臺期(圖2B)。故選擇100 nmol/L終濃度作為miR27a mimics和miR27a inhibitors的最優(yōu)轉(zhuǎn)染濃度。

2.3miR27a對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響 對照組、脂質(zhì)體組和Negative組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖曲線基本相似，增殖速度無明顯差異，而miR27a mimics組與Negative組相比結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖速度顯著升高(P<0.05)，且miR27a inhibitors組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖速度比Negative組明顯下降(P<0.05)。見圖3。

圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR27a mimics和miR27a inhibitors后的表達(dá)水平

圖3 miR27a對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4miR27a對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 對照組細(xì)胞具有一定的侵襲能力，48 h穿過8 μm孔徑的細(xì)胞數(shù)為(30±6)個，脂質(zhì)體組和Negative組侵襲能力與對照組一致，穿過8 μm孔徑的細(xì)胞數(shù)分別為(28±5)和(28±9)個。而miR27a mimics轉(zhuǎn)染組穿過8 μm孔徑的細(xì)胞數(shù)〔(51±10)個〕比Negative組的侵襲能力顯著增加(P<0.05)；而與Negative組相比，miR27a inhibitors轉(zhuǎn)染組的侵襲能力明顯下降，其48 h穿過8 μm孔徑的細(xì)胞數(shù)為(15±4)個(P<0.05)。

3 討 論

結(jié)腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如糖尿病、炎性腸病和吸煙等〔7〕。已有文獻(xiàn)報道m(xù)iR196a、miR146a、miR27a和miR200a等在胰腺癌和卵巢癌等嚴(yán)重疾病中均出現(xiàn)表達(dá)差異，且發(fā)揮了十分重要的作用〔8～10〕。

本研究結(jié)果提示miR196 m、miR146a、miR27a、miR200a對癌細(xì)胞的功能如增殖能力和侵襲能力等都可能有顯著影響。另外隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加，miR27a mimics和miR27a inhibitors對miR27a的調(diào)控作用越明顯，綜合考慮，選100 nmol/L作為轉(zhuǎn)染的優(yōu)化濃度，而且miR27a能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。除增殖能力之外，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也是反映其惡性程度的一項重要指標(biāo)，miR27a能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

綜上，結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌細(xì)胞中，miR27a的表達(dá)顯著上調(diào)，而miR27a的上調(diào)則能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)一步發(fā)展和惡化。本研究彌補(bǔ)了這些miRNA在結(jié)腸癌研究中的不足，也為進(jìn)一步深入研究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了一種新的可能性。

4 參考文獻(xiàn)

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