鈣網(wǎng)蛋白在大腸癌組織的表達及意義

王 彭 宋麗娜 師慶紅 李玲霞 李洪軍 印 璞 趙海豐 郭宏華 何成彥

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

鈣網(wǎng)蛋白(CRT)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)中高度保守的主要的Ca2+結(jié)合蛋白，能調(diào)節(jié)細胞多種生理功能，可協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊、修飾，維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)，參與抗原提呈、調(diào)節(jié)細胞凋亡等，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)〔1，2〕。近年來CRT在惡性腫瘤發(fā)生、診斷、治療中的作用逐漸受到重視，在各種惡性腫瘤中的研究也成為熱點，但是關(guān)于CRT在大腸癌中的研究較少。本文應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究CRT在大腸癌及癌旁組織中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院20例手術(shù)治療的大腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本(均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為腺癌)及各患者距離腫瘤組織邊緣10 cm以外的上端癌旁組織標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未接受任何治療，年齡60～70歲，男14例，女6例。將獲得的新鮮標(biāo)本離體后用生理鹽水沖洗干凈，放入液氮冷凍，-80℃保存。

1.2主要試劑及儀器 碘代乙酰胺(IAA)、載體兩性電解質(zhì)(Bio-Lyte 3-10)、IPG 預(yù)制膠條(pH3～10，17 cm;pH5～8，17 cm)、礦物油、尿素、硫脲、三羥甲基氨基甲烷、3-1〔(3-膽酰胺丙基)-二乙胺〕-丙磺酸、碳酸氫氨、苯甲基磺酰氟購自Bio-Rad公司，丙烯酰胺、 TMED、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250、苯甲基磺酰氟(PMSF)購自Sigma公司，低熔點瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、DTT、TPCK 修飾的測序級胰酶購自普洛麥格公司。過硫酸銨、碳酸氫氨、硝酸銀、甲醛、乙醇、硫代硫酸鈉、冰乙酸均為國產(chǎn)分析純。蛋白質(zhì)定量試劑盒(RC DC Protein A ssay Kit)購于Bio-Rad 公司。液相色譜分析儀購自安捷倫公司，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購自賽默飛世爾公司。

1.3實驗方法

1.3.1樣品總蛋白提取及蛋白濃度測定 取50 mg組織研磨，加入200 μl預(yù)冷的組織蛋白抽提試劑，置冰上20 min。4℃，12 000 r/min離心1 h，留取上清備用。考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，595 nm處比色，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，A595 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品中蛋白質(zhì)含量，-80℃保存。

1.3.2樣品蛋白水解多肽混合物的制備 取出凍存總蛋白樣品，平衡至室溫。用3～5倍體積的50 mmol/L NH4HCO3溶解蛋白樣品。加入1 mol/L的DTT，調(diào)定終濃度至20 mmol/L，室溫、避光放置1 h。室溫下加入1 mol/L的IAM，調(diào)定終濃度至50 mmol/L，室溫、避光反應(yīng)半小時。反應(yīng)體系中按照蛋白∶胰酶以50∶1比例加入，放在37℃水浴箱中過夜。 酶切產(chǎn)物，-80℃凍干保存。

1.3.3二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分離并鑒定多肽混合物 將樣本用緩沖液溶解，取50 μg樣本上樣，經(jīng)反相色譜洗脫的多肽用 LTQXL離子肼質(zhì)譜儀檢測，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用 Thermo Fisher公司的 Bioworks 3.3.1 SP1軟件，用SEQUEST進行數(shù)據(jù)庫檢索，以鑒定相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)。

1.3.4免疫印跡試驗檢測CRT表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤組織及癌旁組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析 腫瘤組織及癌旁組織總蛋白酶解產(chǎn)物應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，對獲得的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、整理，分別得到536、324個蛋白的鑒定資料。

2.2腫瘤與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 本實驗應(yīng)用譜圖數(shù)評價每個蛋白的豐度。蛋白豐度的變化參照以下標(biāo)準(zhǔn)界定：①兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72,②兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1。

將腫瘤組織與癌旁組織的蛋白分析數(shù)據(jù)依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進行比對，得到有顯著差異的蛋白16 個。CRT的質(zhì)譜圖見圖1。

2.3CRT的免疫印跡結(jié)果 見圖2。

圖1 CRT的質(zhì)譜圖

圖2 CRT的免疫印跡圖

3 討 論

大腸癌是發(fā)病率和死亡率都較高的惡性腫瘤，雖然目前采取的放療、化療等綜合療法已取得一定效果，提高了患者的5年生存率，但仍有許多患者在疾病診斷時已經(jīng)錯過了治療的最佳時機，因此對于腫瘤的早期診斷仍是研究的熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平以及修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，并且提示蛋白質(zhì)的功能與細胞的活動規(guī)律。相對于傳統(tǒng)的篩選方法，其檢測更快、更準(zhǔn)確、省時省力，并且對一個組織內(nèi)的全部蛋白質(zhì)一次檢測就可得出結(jié)果，效率有很大的提高，通過對差異蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，可發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性高的早期腫瘤標(biāo)志物，對腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供了很大的便利。

本研究證明了在大腸癌組織中CRT的含量明顯高于癌旁組織。有研究表明，在非小細胞肺癌、胰腺癌等腫瘤中CRT的含量與正常組織有明顯差異〔3，4〕，說明CRT在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定的作用。雖然具體機制仍需深入探索，但這也使其有望成為診斷大腸癌的標(biāo)志物之一。

腫瘤的發(fā)生會伴隨著血管的生成，研究發(fā)現(xiàn)，CRT可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖而抑制腫瘤血管的生成〔5〕。CRT還可通過改變鈣穩(wěn)態(tài)、抑制Akt通路等多種途徑調(diào)節(jié)細胞的凋亡〔6〕，從而延緩腫瘤的進展，并可增強腫瘤的放化療效果〔7〕，這也使其在腫瘤治療方面具有廣泛前景。

4 參考文獻

1徐菲菲，劉秀華.鈣網(wǎng)蛋白的生理及病理生理學(xué)作用〔J〕.生理科學(xué)進展，2006；37(3):216-20.

2吳 薇，劉朝奇.鈣網(wǎng)蛋白免疫調(diào)節(jié)的分子機制研究〔J〕.生物技術(shù)通報，2013；3(3):213-5.

3徐志峰，王劍平，王明元，等.胰腺癌自身免疫中鈣網(wǎng)蛋白的表達〔J〕.胃腸病學(xué)與肝病學(xué)雜志，2008；9(4):543-5.

4王富強，許志洋，胡 凡，等.非小細胞肺癌組織磷酸化蛋白p27和鈣網(wǎng)蛋白的水平研究〔J〕.中外醫(yī)療，2013；29(3):345-7.

5Yao L，Pike SE，Tosato G，etal. Laminin binding to the Calreticulin fragment vasostatin regulates endothelial cell function〔J〕. Leukocyte Biology，2002；71(1):47253.

6曹春雨，王艷林.鈣網(wǎng)蛋白與凋亡細胞清除〔J〕.生命的化學(xué)，2008；28(3):283-5.

7高樹峰，徐 蓮，張少容，等.鈣網(wǎng)蛋白與腫瘤治療〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013；11(7):873-5.