結(jié)締組織生長因子在糖尿病大鼠腎臟損傷中的作用及絲膠的干預(yù)效果

楊振軍 劉東慧 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是與促進纖維化和細胞外基質(zhì)(ECM)沉積密切相關(guān)的細胞因子，可通過促進ECM沉積在腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等方面發(fā)揮重要作用〔1〕。人體的多種組織器官，如心血管系統(tǒng)、腦、肝臟、骨骼肌、消化道、腎臟和胰腺等均發(fā)現(xiàn)有CTGF存在，其中腎臟的含量最高，但在生理情況下CTGF的表達水平很低〔2〕。目前，治療糖尿病多采用控制飲食、運動、口服降糖藥物、注射胰島素等方法，但上述方法均有其治療的局限性，并且均不能有效改善胰島素抵抗及保護胰島細胞〔3,4〕。根據(jù)民間蠶繭泡水輔助降糖的用法，本課題組進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低血糖、改善糖尿病時血脂代謝紊亂及保護糖尿病時生殖功能障礙〔5,6〕。

1 材料與方法

1.1動物、分組及處理 48只清潔級健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：712024。隨機選取其中的12只作為正常對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量鏈脲佐菌素(STZ)溶劑3次(1次/d)；其余的36只大鼠按25 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射2％的STZ，成模標(biāo)準(zhǔn)是注射STZ 1 w后空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L〔7〕。成功建立2型糖尿病模型的大鼠隨機分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽性對照組，每組12只，絲膠治療組大鼠按照2.4 g·kg-1·d-1的劑量灌胃給予絲膠35 d，陽性對照組大鼠灌胃給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)35 d，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水35 d。

1.2藥物和試劑 絲膠(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所)：浸泡后水煎2次，合并濾液并濃縮。STZ美國Sigma公司，用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)配制；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；纖維連接蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗CTGF多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)，美國KPL公司；BCA蛋白定量試劑盒、藍色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、蛋白裂解液、1 200 bp DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；β-actin單克隆抗體，美國Santa公司；Trizol，美國Invitrogen公司；CTGF、β-actin引物，上海生工公司；PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.3檢測血液指標(biāo) 4％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心20 min后收集血清，-20℃冰箱保存。葡萄糖氧化酶法檢測血糖，ELISA法檢測纖維連接蛋白含量。

1.4大鼠腎臟CTGF表達的檢測 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1Western 印跡法檢測CTGF蛋白的表達 取液氮保存腎臟提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。每個上樣孔加80 μg總蛋白行12％ SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5％脫脂奶粉37℃封閉1 h，加一抗(β-actin 1∶1 000、CTGF 1∶100)于4℃過夜；洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫搖床孵育1 h，洗膜后加入Super ECL Plus超敏發(fā)光液，曝光后掃描。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對Western條帶進行定量分析，以目的蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為CTGF蛋白的相對表達水平。

1.4.2RT-PCR法檢測CTGF mRNA的表達 取液氮保存腎臟，按Trizol試劑說明提取腎臟總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物進行PCR。PCR引物序列：CTGF正義鏈:5’- CCTACCGACTGGAAGACACATT-3’，反義鏈:5’-GATGCACTTTTTGCCCTTCTTA-3’，退火溫度56℃，循環(huán)次數(shù)：30次，產(chǎn)物大小230 bp；β-actin正義鏈:5’-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反義鏈:5’-CTGGAAGGTGGACAGTGAG’-3，退火溫度55℃，循環(huán)次數(shù)：29次；產(chǎn)物大小445 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl，取5 μl擴增產(chǎn)物及5 μl DNA Ladder行2％瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件進行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為CTGF mRNA的相對表達水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎臟CTGF的表達 模型組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達較正常對照組大鼠高(P<0.01)；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達，絲膠治療組、陽性對照組大鼠腎臟CTGF蛋白及mRNA的表達明顯較模型組大鼠低(P<0.01，P<0.05)。見圖1，圖2、表1。

圖1 大鼠腎臟CTGF mRNA的表達

2.2各組大鼠的血糖和血清纖維連接蛋白的含量 與正常對照組比較，模型組大鼠的血糖、纖維連接蛋白的含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，絲膠治療組、陽性對照組大鼠的血糖和纖維連接蛋白的含量明顯降低(P<0.01)。見表1。

1.正常對照組，2.模型組，3.絲膠治療組，4.陽性對照組,下圖同

與模型組比較：1) P<0.01,2) P<0.05

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，3～5個月的糖尿病大鼠，腎小球和整個腎皮質(zhì)CTGF mRNA的表達均明顯增加〔8〕；本研究也證實了這一點，糖尿病模型大鼠腎臟CTGF蛋白和mRNA的表達水平明顯升高。糖尿病時，高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ、5-羥色胺等均可導(dǎo)致腎臟CTGF表達水平的升高〔9,10〕。CTGF表達上調(diào)后，一方面通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性打破MMPs/TIMPs的平衡，使ECM合成和降解的平衡失調(diào)，從而引發(fā)腎間質(zhì)纖維化〔11,12〕；另一方面，CTGF可在許多方面介導(dǎo)TGF-β1的致腎臟纖維化作用〔13〕。CTGF作為介導(dǎo)TGF-β1致纖維化的因子，可通過促進細胞有絲分裂和TGF-β1的作用，使ECM成分合成增加、降解減少，進而導(dǎo)致腎臟肥大、腎小球硬化以及腎小管纖維化〔14〕。研究資料顯示，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和CTGF刺激細胞能加速ECM合成，而降低TGF-β1和CTGF的表達，可通過減少ECM合成保護腎臟損傷〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠血清ECM成分纖維連接蛋白的含量，降低糖尿病模型大鼠腎臟CTGF的表達。本研究表明，絲膠可通過下調(diào)CTGF的表達，一方面恢復(fù)糖尿病時腎臟MMPs/TIMPs的平衡狀態(tài)，另一方面拮抗CTGF介導(dǎo)的TGF-β1的致腎臟纖維化的作用；因此，絲膠可通過減少ECM的合成恢復(fù)ECM合成和降解的平衡，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮對糖尿病腎臟損傷的保護作用。本研究為進一步開發(fā)利用蠶繭治療糖尿病及其并發(fā)癥提供了可靠的實驗資料。由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶來的毒副作用，值得進一步探討絲膠治療糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)作用及機制。

4 參考文獻

1Ito Y,Aten J,Nguyen TQ,etal.Involvement of connective tissue growth factor in human and experimental hypertensive nephrosclerosis〔J〕.Nephron Exp Nephrol,2011;117(1):e9-20.

2Wada J,Makino H,Kanwar YS.Gene expression and identification of gene therapy targets in diabetic nephropathy 〔J〕.Kidney Int,2002;61(1): S73-8.

3Kang JH,Chae YM,Park KK,etal.Suppression of mesangial cell proliferation and extracellular matrix production in streptozotocin-induced diabetic rats by Sp1 decoy oligodeoxynucleotide in vitro and in vivo〔J〕.J Cell Biochem,2008;103(2):663-74.

4McAlister FA,Eurich DT,Majumdar SR,etal.The risk of heart failure in patients with type 2 diabetes treated with oral agent monotherapy 〔J〕.Eur J Heart Fail,2008;10(7):703-8.

5付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠是血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(1)：103-5.

6趙連志，楊松鶴，李山山，等.絲膠預(yù)處理對糖尿病大鼠睪丸生長激素和生長激素受體表達的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012;32(9)：1850-2.

7Liu Y,Qi H,Wang Y,etal.Allicin protects against myocardial apoptosis and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats 〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):693-8.

8唐 慶，王小琴，馬 俊，等.腎安提取液對糖尿病腎病小鼠腎臟結(jié)締組織生長因子及Ⅳ型膠原的影響〔J〕.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010;33(2)：71-3.

9Du J,Wang L,Liu L,etal.IFN-γ suppresses the high glucose-induced increase in TGF-β1 and CTGF synthesis in mesangial cells 〔J〕.Pharmacol Rep,2011;63(5):1137-44.

10欒 健，王 艷，馬瑞霞，等.復(fù)方腎炎片對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠作用研究〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2010;11(11)：1000-2.

11劉 圣，胡世蓮，葉山東，等.結(jié)締組織生長因子與糖尿病腎病及中藥干預(yù)〔J〕.中國臨床保健雜志，2010;13(1)：101-4.

12Wang X,Zhou Y,Tan R,etal.Mice lacking the matrix metalloproteinase- 9 gene reduce renal interstitial fibrosis in obstructive nephropathy 〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;299(5): F973-82.

13Hao HH,Shao ZM,Tang DQ,etal.Preventive effects of rutin on the development of experimental diabetic nephropathy in rats 〔J〕.Life Sci,2012;91(19-20):959-67.

14楊 敏，黃海長，李驚子，等.結(jié)締組織生長因子協(xié)同轉(zhuǎn)化生長因子β1的促腎纖維化效應(yīng)〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2004;84(7)：569-72.

15Fujita H,Fujishima H,Takahashi K,etal.SOD1,but not SOD3,deficiency accelerates diabetic renal injury in C57BL/6-Ins2(Akita) diabetic mice 〔J〕.Metabolism,2012;61(12):1714-24.

16馬瑞霞，徐 巖，張 娟，等.雷云藤甲素聯(lián)合厄貝沙坦對2型糖尿病大鼠細胞損傷的協(xié)同保護作用[J].中華內(nèi)科雜志，2012;51(2):117-22.