電針調(diào)節(jié)腦缺血再灌注模型大鼠大腦皮層Nrf2蛋白的表達

沈梅紅 沈 潔 舒兆瑞 張 瑩 穆艷云 李忠仁

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

氧化應(yīng)激學(xué)說是缺血性中風(fēng)的重要機制之一，而電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠具有明顯的抗氧應(yīng)激保護作用〔1〕。紅系核因子2(NF-E2)相關(guān)因子(Nrf2)目前認為是調(diào)控細胞對抗外來異物和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2缺失或激活障礙，會引起細胞對應(yīng)激源的敏感性增高，與細胞凋亡、炎癥修復(fù)進程延長、化學(xué)促癌的發(fā)生等病變過程密切相關(guān)〔2〕。近來研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在氧化應(yīng)激性疾病中起著重要的調(diào)控作用，Nrf2的激活可誘導(dǎo)一系列內(nèi)源性抗氧化酶和抗氧化蛋白上調(diào)，參與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)的基礎(chǔ)性和誘導(dǎo)性表達〔3〕，協(xié)同加強細胞清除ROS/RNS的防御系統(tǒng)，維持細胞內(nèi)的還原電位。但大鼠局灶性腦缺血再灌注后Nrf2表達狀態(tài)尚未見報道。本研究擬利用大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型，采用免疫組化方法觀察缺血再灌注損傷后大腦皮層細胞上Nrf2蛋白表達情況，并探索電針干預(yù)作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 多聚甲醛 (分析純，批號：20071217)：購自成都科龍化學(xué)試劑廠，用0.01 mol/L PBS緩沖液配成4％濃度備用；一抗(Nrf2兔抗大鼠單克隆抗體)購自美國Santa Cruz公司(批號：K2008，用抗體稀釋液1∶150稀釋)；二抗及免疫組化測試盒(SABC)購于武漢博士德公司；多聚賴氨酸及DAB顯色液等免疫組化輔助試劑購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.1.2實驗動物 15只清潔級Sprague Dawley健康雄性大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(許可證號：SCXK(滬)2007-0005)，所有大鼠均自由攝食、飲水，生活在晝夜節(jié)律為12 h/12 h且保持一定濕度和25℃的空間內(nèi)。適應(yīng)性喂養(yǎng)至體重(300±20)g后進行實驗研究。

1.1.3實驗儀器 Olympus BX50生物組織顯微鏡(日本)；Olympus DP71圖像獲取系統(tǒng)(日本)；JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)；WQ1002K電針儀(安隆光電技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組、模型制備及電針治療方法 根據(jù)數(shù)字隨機表將實驗大鼠隨機分成假手術(shù)組大鼠(n=5)和造模大鼠(n=10)，后者采用改良Longa線栓大腦中動脈法制作局灶性腦缺血再灌注模型，將神經(jīng)缺損綜合評分為2分以上大鼠隨機分為缺血再灌注模型組(模型組)、腦缺血再灌注模型+電針“百會”、“大椎”穴組(電針組)，每組5只 。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)過程，除不插入線栓外其余步驟與模型組大鼠一致。

缺血2 h再灌注開始即刻對電針組大鼠施以麻醉狀態(tài)下的電針治療。按經(jīng)絡(luò)循行及神經(jīng)節(jié)段分布特點，依據(jù)中國中醫(yī)藥出版社《實驗針灸學(xué)》(2007年出版)所附動物穴位圖譜選取“百會”、“大椎”穴。采用華佗牌不銹鋼一次性毫針(F 0.30 mm×25 mm)進行針刺操作，“百會”穴平刺，“大椎”穴約30°角斜刺，深度均為10 mm。刺激參數(shù)：連續(xù)波，刺激強度以針柄輕微顫動、大鼠穴位局部抖動，大鼠不嘶叫為宜 (頻率：3 Hz，電流強度：1～3 mA)。持續(xù)電刺激30 min。模型組與假手術(shù)組大鼠施以相同麻醉，但不進行電針治療。

1.2.2免疫組織化學(xué)法觀察Nrf2蛋白表達情況 實驗動物再灌注24 h后，經(jīng)水合氯醛麻醉后開胸腹，先后用生理鹽水、4％多聚甲醛固定液灌流，并固定過夜后，將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，取尾側(cè)第2片腦組織。經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片(每片厚5 μm)后，每只動物取1張組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，方法按Nrf2蛋白免疫組化測試盒操作說明進行操作。經(jīng)脫水、透明和封片后，光學(xué)顯微鏡觀察大腦皮層錐體細胞層細胞改變，并用Olympus顯微圖像獲取系統(tǒng)400倍拍攝圖像。每張切片隨機觀察5個視野，計算每只動物的陽性細胞數(shù)，取平均值，即為該組動物該區(qū)域的陽性細胞數(shù)。采用圖像分析系統(tǒng)測定視野中陽性細胞的平均灰度、平均光密度，以評估Nrf2蛋白陽性細胞的Nrf2含量變化。

2 結(jié) 果

2.1光鏡觀察圖 光鏡下觀察，大鼠大腦皮層Nrf2蛋白免疫組化反應(yīng)顯色呈棕黃色，陽性細胞分布于皮層分子層外的各個細胞層，以錐體細胞層表達明顯，表達部位主要位于胞質(zhì)和核膜上。假手術(shù)組偶見陽性細胞，著色褐黃色；模型組錐體細胞層表達Nrf2細胞數(shù)增多，著色稍深；而電針組免疫陽性細胞分布密集，胞體大，著色深，胞質(zhì)和胞核均有表達。見圖1。

圖1 各組大鼠皮層錐體細胞層Nrf2蛋白表達(×400)

2.2大腦皮層Nrf2蛋白陽性細胞數(shù)的觀察 假手術(shù)組、模型組大鼠大腦皮層均可檢測到Nrf2蛋白陽性細胞，其中模型組大鼠大腦皮層表達Nrf2蛋白的細胞數(shù)(34.25±6.34)較假手術(shù)組(19.00±6.27)升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。電針組大腦皮層中可見到大量的Nrf2蛋白陽性細胞數(shù)(84.20±14.18)，與模型組、假手術(shù)組相比均有顯著性差異。

2.3電針對大腦皮層表達Nrf2蛋白陽性細胞的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大腦皮層錐體細胞層的Nrf2蛋白陽性細胞的平均灰度有下降趨勢，平均光密度有上升的趨勢；電針組的平均灰度明顯低于模型組，平均光密度明顯高于模型組。見表1。

表1 電針對大腦皮層Nrf2蛋白陽性細胞平均灰度、平均光密度的影響

3 討 論

研究表明〔2～4〕，作為一種轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2)和胞質(zhì)接頭蛋白(Keap1)是細胞抗氧化反應(yīng)中樞調(diào)節(jié)者。生理狀態(tài)下兩者結(jié)合，Nrf2活性處于相對抑制狀態(tài)，半衰期短，約為20 min，經(jīng)泛素化可快速降解。在氧化應(yīng)激源作用下，因Keap1在C273、C288、C157部位存在巰基(-SH)，易失去電子，形成二硫鍵(-S-S-)，從而使Keap1構(gòu)型發(fā)生改變，引起Nrf2與keap1解偶連后，Nrf2穩(wěn)定性增加并激活，轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上GCTGAGTCA位點結(jié)合，調(diào)節(jié)絕大多數(shù)抗氧化基因的表達抗氧化酶基因表達，增加細胞對氧化應(yīng)激抗性。Nrf2通過與Keap1的相互作用，感受細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的變化，特別是細胞內(nèi)巰基量的變化。Nrf2通過與ARE相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白表達，是細胞抗氧應(yīng)激防御保護中關(guān)鍵一步。Keap1-Nrf2/ARE通路在抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)GSH合成、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、神經(jīng)保護等方面發(fā)揮著廣泛細胞保護功能。Nrf2/ARE信號通路的激活可誘導(dǎo)一系列內(nèi)源性的細胞保護基因上調(diào)，其中包括一系列的抗氧化酶和抗氧化蛋白，這些酶類和蛋白可通過催化自由基轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)和增加其水溶性，利于自由基排除，可協(xié)同加強細胞的抗氧化防御系統(tǒng)。Rubiolo〔5〕利用H2O2刺激大鼠肝臟原代細胞，認為Nrf2可促進SOD、CAT的表達。Kim等〔6〕把老年大鼠的樹突狀細胞移植到年青大鼠會導(dǎo)致年輕大鼠免疫能力下降，但是將經(jīng)Nrf2激動劑體外刺激來源于衰老大鼠的樹突細胞移植到年青鼠則可以提高其抗氧化酶和GSH合成能力。而Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源細胞毒性，導(dǎo)致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡。如Kim等〔7〕發(fā)現(xiàn)在耐三苯氧胺藥的肺癌細胞中谷胱甘肽 (GSH)和細胞核的Nrf2含量均高于普通肺癌細胞，但把Nrf2顯性負相的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進耐藥的肺癌細胞時，發(fā)現(xiàn)GSH含量大幅度下降，直接證明Nrf2是GSH的表達轉(zhuǎn)錄因子。

Yang等〔8〕在大鼠局部腦缺血后給予注射Nrf2激動劑-姜黃后，Nrf2、HO-1mRNA和蛋白水平均明顯升高，并能有效地減小梗死區(qū)域、降低腦組織水腫、改善神經(jīng)功能評分。前期研究〔1，9〕表明，腦缺血再灌注時腦組織內(nèi)GSH含量及GSH-Px、GR活性均下降，機體表達γ-GCSh mRNA、γ-GCSl mRNA和γ-GCS蛋白能力無明顯提高；而電針可促進大腦皮層中GCSh和GCSl拷貝數(shù)增加和錐體細胞表達大量的γ-GCS蛋白，從而提高GSH含量及GSH-Px、GR活性促進機體谷胱甘肽系統(tǒng)清除氧自由基。

本研究表明在大腦缺血再灌注時產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，可誘導(dǎo)大腦皮層表達少量的Nrf2蛋白。而給予“百會”、“大椎”兩穴的電針刺激后，Nrf2蛋白明顯增加，結(jié)合前期研究結(jié)果推測電針可通過增加Nrf2蛋白質(zhì)的表達來發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗氧化酶γ-GCS水平繼而調(diào)節(jié)GSH-Px、GR及GSH含量最后達到保護機體免受自由基損傷的目的。

4 參考文獻

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