按摩通過(guò)改善VEGF活性及血供促進(jìn)兔骨骼肌損傷修復(fù)

謝 輝 唐成林 陳曉琳 唐念珍 韋貴勇

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)藥研究室，重慶 400016)

肌肉鈍挫傷是肌肉損傷發(fā)生率最高的一種，常見于對(duì)抗性體育項(xiàng)目或意外事故〔1〕。對(duì)日常生活和繼續(xù)參加體育運(yùn)動(dòng)均造成不利影響〔2〕。對(duì)于老年人來(lái)講，跌撲損傷更易發(fā)生，影響正常體育活動(dòng)，甚至影響正常生活。損傷造成機(jī)體部分細(xì)胞和組織喪失后，機(jī)體對(duì)所形成的缺損進(jìn)行修補(bǔ)恢復(fù)的過(guò)程稱為修復(fù)，修復(fù)后可完全或部分恢復(fù)原組織的結(jié)構(gòu)和功能。本文觀察骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中形態(tài)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的變化，探討按摩在骨骼肌挫傷恢復(fù)過(guò)程中的作用及其應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和制模 實(shí)驗(yàn)兔為純種健康成年雄性新西蘭大白兔42只，體重(2.0±0.5)kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證SCXK渝20120001)，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后被隨機(jī)分為正常組(A 組，n=3)、按摩前損傷組(B組，即損傷后第3天，n=3)、損傷后第5天按摩組(C組，n=9)和自然恢復(fù)組(D組，n=9)、損傷后第10天按摩組(E組，n=9)和自然恢復(fù)組(F組，n=9)。

采用重物打擊法制作兔股四頭肌急性損傷模型〔3〕。用自制底面平滑的重力鉛錘(錘長(zhǎng)10 cm、重0.5 kg、直徑2.5 cm；塑料導(dǎo)向管長(zhǎng)100 cm，直徑3.0 cm)進(jìn)行重力打擊，為保證每只實(shí)驗(yàn)兔所受撞擊力度和損傷范圍一致，由同一人執(zhí)行每次的鉛錘投放和導(dǎo)管固定。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見打擊部位出現(xiàn)腫脹和淤血，同肌肉撞傷相似，無(wú)皮膚破裂及骨折。

1.2試劑和儀器 主要試劑：8％硫化鈉脫毛劑，Ⅰ抗：VEGF 抗體(北京博奧森)；Ⅱ抗：辣根過(guò)氧化物標(biāo)記生物素(北京博奧森)；BCA蛋白定量試劑盒250次(上海貝博)。

主要儀器：酶標(biāo)儀(Biocell，中國(guó))；Chem Gel-DocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)；電泳儀(DYY-6C，中國(guó)北京六一儀器廠)；AFY-10按摩器(天津京康瑞福科技發(fā)展有限公司)；荷蘭飛利浦公司產(chǎn)飛利浦iu22 高端彩超診斷儀(L12-5 高頻探頭，頻率10 MHz)。

1.3方法

1.3.1按摩干預(yù) 造模后第4天開始按摩治療〔4〕，對(duì)照組不進(jìn)行。1次/d，15 min/次，按摩轉(zhuǎn)速為2 600 r/min，直接在受損組織及臨近部位按摩，直至處死取材。

1.3.2超聲檢查 經(jīng)耳緣靜脈注射3％戊巴比妥鈉(25 mg/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔行全身麻醉，經(jīng)8％硫化鈉脫毛，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上用膠布固定。造影劑于使用前注入3 ml雙蒸水，迅速振搖至其完全溶解，于耳緣靜脈注射，即刻對(duì)受損股四頭肌用飛利浦iu22高端彩超診斷儀進(jìn)行局部超聲診斷，觀察并記錄回波圖像。

1.3.3取材與預(yù)處理 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于損傷后第5、10天，空氣栓塞法處死?？焖偾腥≡炷Ｌ幑伤念^肌，即刻對(duì)受損股四頭肌用預(yù)冷PBS清洗，縱切取4塊，將其中2塊(1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm)肌組織標(biāo)本，于4％多聚甲醛固定液固定過(guò)夜，用于H&E染色(固定組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木精和伊紅染色)。另2塊(約1.5 cm×1.0 cm×0.3 cm)標(biāo)本立即置液氮冷凍，于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于Western印跡檢測(cè)。

1.3.4Western印跡檢測(cè)兔骨骼肌中VEGF表達(dá) 取股四頭肌樣本加入適量組織細(xì)胞裂解液，電動(dòng)勻漿器攪碎，冰浴30 min裂解，12 000 r/min離心5 min后取上清，測(cè)定蛋白濃度。40 μg蛋白經(jīng)10％ SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至NC膜，麗春紅染色，有條帶則繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。5％脫脂牛奶封閉，PBST 漂洗3次；加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜，取出Ⅰ抗，PBST漂洗3次，10 min/次；加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的Ⅱ抗，搖床輕搖1 h，TBST室溫脫色搖床上洗3次，每次10 min；將膜置入發(fā)光盤中，加入發(fā)光試劑( ECL)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析獲取目標(biāo)蛋白、內(nèi)對(duì)照蛋白的灰度密度值，目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值評(píng)價(jià)各組VEGF的變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，同組兩時(shí)間點(diǎn)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1按摩對(duì)形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察，正常組肌纖維排列整齊，且大小一致(圖1A)。損傷后第3天組，肌纖維大量斷裂、崩解，部分萎縮，肌纖維明顯萎縮、扭曲、壞死，間隙明顯增大，炎癥反應(yīng)明顯(圖1B)。損傷后第5天兩組肌纖維萎縮、壞死均明顯減輕，自然恢復(fù)組與按摩組相比炎癥反應(yīng)仍較明顯，且肌纖維間隙較大、排列紊亂，可見明顯結(jié)締組織填充，而按摩組新生的肌纖維明顯較對(duì)照組多，且排列緊密(圖1C，1D)。損傷后第10天，按摩組肌纖維排列相比對(duì)照組更緊密整齊，肌纖維間見少量結(jié)締組織填充，同正常組逐漸較接近，而損傷后第10天自然恢復(fù)組肌纖維排列仍較紊亂，結(jié)締組織同肌纖維交織，顏色呈蒼白色，肌纖維之間仍有結(jié)締組織填充(圖1E，1F)。

A：正常組；B：傷后第3天組；C：傷后第5天按摩組；D：傷后第5天自然恢復(fù)組；E：傷后第10天按摩組；F：傷后第10天自然恢復(fù)組；下圖同

2.2按摩對(duì)損傷局部血供的影響 正常組(2A)肌肉血供良好；制模后第3天組(2B)可見大范圍的壞死組織，且內(nèi)部無(wú)血液供應(yīng)，無(wú)血管生成；制模后第5天按摩組(2C)顯示壞死范圍較自然恢復(fù)組(2D)減小，有部分微泡可見于壞死組織內(nèi)部，表明壞死組織內(nèi)部血管部分生成，其周圍微泡密度和亮度均較自然恢復(fù)組(2D)高。制模后第10天自然恢復(fù)組(2F)可見血液供應(yīng)仍不佳，壞死范圍也明顯減少，但與按摩組(2E)仍有較大差別，此時(shí)按摩組(2E)只有微小的壞死組織，血液供應(yīng)情況很好，與正常組織逐漸接近。

圖2 超聲微泡顯示結(jié)果

2.3按摩對(duì)VEGF表達(dá)量的影響 VEGF在正常組織中幾乎不表達(dá)，損傷后修復(fù)過(guò)程中各組與正常組(0.06)比較表達(dá)均顯著增多(P<0.01)。損傷后第3天組VEGF相對(duì)表達(dá)量(0.78)明顯高于正常組(P<0.01)，經(jīng)過(guò)按摩干預(yù)后，損傷后第5天，按摩組VEGF表達(dá)水平(0.80)較自然恢復(fù)組(0.63)偏高(P<0.01)；同樣，損傷后第10天，VEGF在自然恢復(fù)組(0.20)表達(dá)水平明顯低于按摩組(0.27)(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組VEGF表達(dá)

3 討 論

血液循環(huán)系統(tǒng)在組織損傷修復(fù)過(guò)程中的作用是不可替代的。血管形成主要包括血管發(fā)生，血管生成和動(dòng)脈生成3個(gè)過(guò)程〔5〕。骨骼肌損傷后，會(huì)造成局部缺血缺氧，在低氧和炎癥的刺激下巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞均能分泌VEGF〔6，7〕。VEGF及其受體是血管生成中最好的特色信號(hào)路徑〔8〕。我們前期的研究顯示，按摩可以改善血液“濃、粘、凝、聚”的狀態(tài)，加快血液流動(dòng)，改善血液黏稠度，利于損傷區(qū)域充足血供，并減輕局部壞死，為組織細(xì)胞提供更多的血氧，有利于局部?jī)?nèi)環(huán)境的改善，減少了組織細(xì)胞的變性、壞死〔9〕。

VEGF是一種具有肝素結(jié)合活性的生長(zhǎng)因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在許多正常組織組織中廣泛存在，如腦、皮膚、肺、腎、心肌、骨骼肌和小腸等許多組織都有不同程度的表達(dá)，是具有高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素。在我們的實(shí)驗(yàn)中也可觀察到，正常組織中VEGF表達(dá)很少，損傷后其表達(dá)量迅速增加。VEGF的作用很多：①促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子。有研究表示，VEGF的表達(dá)與組織中微血管的密度及新生血管的數(shù)量密切相關(guān)〔10〕，可明顯促進(jìn)拉傷處內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管形成，加快血管內(nèi)皮的愈合〔11〕。②對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響。也有研究顯示，靜脈滴注VEGF可增加心率及心輸出量，降低血管外周阻力，對(duì)心肌收縮力無(wú)明顯的影響〔12〕。③抗血栓，還可促進(jìn)血管內(nèi)細(xì)胞的愈合，使內(nèi)膜內(nèi)皮化，間接地抗血栓形成〔13〕。

本文結(jié)果顯示，按摩組同自然恢復(fù)組相比，新生的肌纖維明顯較對(duì)照組多且排列緊密。在超聲檢查中，經(jīng)按摩干預(yù)后，損傷部位的血液供應(yīng)有了明顯改善，有新生血管生成，微泡密度和亮度均增高，壞死范圍也明顯減少。炎癥趨化因子可以促進(jìn)VEGF的分泌〔15〕，進(jìn)而作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、刺激毛細(xì)血管網(wǎng)的增殖，增加氧的輸送〔16〕。VEGF也可通過(guò)p38MAPK 通路誘導(dǎo)表達(dá)，引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移〔17〕。對(duì)于這一機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和研究。

推拿手法能達(dá)筋骨節(jié)竅之血?dú)饽郎?，甚至還能調(diào)節(jié)情志之苦欲，因而能夠通過(guò)筋骨節(jié)竅實(shí)現(xiàn)移精變氣。推拿具有適應(yīng)面廣泛、手法操作較簡(jiǎn)單、安全性高的特點(diǎn)；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)有治療、調(diào)節(jié)、健體的功能；對(duì)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)有提高人體運(yùn)動(dòng)能力、消除運(yùn)動(dòng)疲勞的作用；對(duì)運(yùn)動(dòng)損傷的康復(fù)具有促進(jìn)血液循環(huán)，改善供血，加速損傷組織修復(fù)、鎮(zhèn)痛、緩解痙攣肌群、關(guān)節(jié)歸順的功能；更對(duì)老年人有縮短療程、減輕痛苦、節(jié)省時(shí)間、節(jié)約開支的價(jià)值。

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