梗阻性黃疸大鼠腎臟水通道蛋白2、內(nèi)皮素-1表達(dá)變化

韓繼龍 王 勇 劉金鋼

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

臨床上梗阻性黃疸病人圍術(shù)期并發(fā)癥和死亡率明顯高于無(wú)黃疸者。其突出的并發(fā)癥和重要的死亡原因就是急性腎衰竭(ARF)，發(fā)生率達(dá)8%～10%，然而死亡率卻可高達(dá)82%〔1〕。肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)作為目前臨床上檢測(cè)腎功能損害的指標(biāo)，當(dāng)它們?cè)龈邥r(shí)腎功能已受到嚴(yán)重?fù)p害，增加了臨床治療困難〔2，3〕。水通道蛋白(AQP)具有特異性強(qiáng)，功能專一，定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)，作為腎功能損害早期改變的研究指標(biāo)是適合的〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，雖然腎臟75%的水在腎近曲小管和直小管降段重吸收，但自由水的調(diào)節(jié)卻在集合管〔5〕。所以腎臟水代謝功能受到集合管的AQP表達(dá)變化的控制〔6〕，AQP2就位于腎集合管，從而明確AQP2在梗阻性黃疸時(shí)表達(dá)變化極為重要。在梗阻性黃疸時(shí)，ARF的病理過(guò)程中，內(nèi)皮素(ET)-1作為最強(qiáng)烈的血管收縮因子，發(fā)揮重要作用，在梗阻性黃疸時(shí)，既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)其增加并導(dǎo)致腎功能損害〔7〕。然而它在腎集合管表達(dá)有何變化，其表達(dá)變化是否對(duì)AQP2表達(dá)有影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察梗阻性黃疸大鼠模型腎集合管AQP2和ET-1表達(dá)及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性Wistar大鼠80只，體重250～300 g，隨機(jī)分成假手術(shù)組和梗死性黃疸(梗黃)組各40只，對(duì)應(yīng)術(shù)后時(shí)間分為3、5、7、10、14 d組，每組8只。處死實(shí)驗(yàn)大鼠對(duì)應(yīng)術(shù)后3、5、7、10、14 d，處死前抽血化驗(yàn)直接膽紅素(DBIL)、BUN、Cr。腎髓質(zhì)標(biāo)本取出后放在液氮中保存，然后再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中冷凍保存。

1.2主要試劑 AQP2一抗(兔抗鼠SA1072)、二抗(羊抗兔SA1076)；ET-1一抗(兔抗鼠SA1062)、ET-1二抗(羊抗兔SA1066)及顯色劑由武漢博士德生物制劑有限公司提供。

1.3生化檢測(cè)及病理組織形態(tài)學(xué)觀察 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血標(biāo)本中DBIL、BUN、Cr值。對(duì)腎髓質(zhì)標(biāo)本用HE染色制片，100倍光鏡觀察。

1.4免疫組織化學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)大鼠腎髓質(zhì)標(biāo)本AQP2及ET-1的測(cè)定采用免疫組化ABC法。在光學(xué)顯微鏡100倍視野下，采用CMIAS圖像分析系統(tǒng)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量其光密度(OD)值后取均數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1腎臟形態(tài)學(xué)改變 假手術(shù)組細(xì)胞排列規(guī)則，間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。梗黃組腎臟顏色晦暗而無(wú)光澤，明顯腫脹。腎集合管上皮細(xì)胞水樣空泡變性、3 d排列不規(guī)整、腫脹、脫落，7 d還可見局灶上皮細(xì)胞壞死，14 d間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胞質(zhì)崩解。見圖1。

2.2生化指標(biāo)改變 Cr在梗黃組10、14 d時(shí)明顯高于假手術(shù)組，BUN在梗黃組14 d明顯高于假手術(shù)組，DBIL在梗黃組較假手術(shù)組明顯增高，生化指標(biāo)隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)(表1)。

2.3免疫組化結(jié)果 術(shù)后5 d開始梗黃組AQP2在腎集合管表達(dá)較手術(shù)組明顯減少(P<0.05)，且隨梗阻時(shí)間增加其減少。見表2。假手術(shù)組胞質(zhì)褐染明顯，整個(gè)胞質(zhì)均褐染。梗黃組3 d胞質(zhì)褐染明顯，但較假手術(shù)組減輕。梗黃組7 d胞質(zhì)褐染減輕，厚度變薄；14 d胞質(zhì)褐染區(qū)明顯變小，僅少量褐染。見圖2。ET-1表達(dá)在梗阻3 d后較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05)，且隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而增加更加明顯。見表2，圖3。

2.4梗黃組AQP2和ET-1表達(dá)相關(guān)性 AQP2與ET-1呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.94,P=0.000 0)。

表1 各組血清DBIL、Cr、BUN值比較±s)

表2 各組腎集合管AQP2、ET-1的OD值比較±s)

圖1 各組腎集合管形態(tài)學(xué)(HE，×100)

圖2 各組腎集合管AQP2表達(dá)免疫組化結(jié)果(×100)

圖3 各組腎集合管ET-1表達(dá)免疫組化結(jié)果(×100)

3 討 論

梗阻性黃疸是肝外膽道及胰腺疾病常見的重要表現(xiàn)之一，黃疸的發(fā)生造成病人圍術(shù)期并發(fā)癥和死亡率升高。其中ARF是主要的并發(fā)癥，也是重要的死亡原因之一。臨床上反映腎功能損害的指標(biāo)為Cr和BUN，而當(dāng)它們發(fā)生改變時(shí)腎功能損害已較嚴(yán)重。人體內(nèi)一些組織器官對(duì)于水有很強(qiáng)的滲透能力，人們預(yù)測(cè)在細(xì)胞膜上可能存在特殊的水通道，但直到1991年Agre等〔8〕對(duì)第一個(gè)AQP基因的cDNA分子進(jìn)行克隆，并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定，其在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上的存在才被證實(shí)。水主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的介質(zhì)為AQP〔9，10〕。由于AQP的發(fā)現(xiàn)，自由水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題得到了合理的解釋。它是水代謝的重要蛋白質(zhì)，具有特異性強(qiáng)，功能專一，定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)，作為腎功能和結(jié)構(gòu)損害早期改變的研究指標(biāo)是適合的〔11〕。近來(lái)各種原因引起的急、慢性腎衰竭時(shí)其變化得到廣泛研究〔12〕。目前了解在腎臟中AQP有多種亞型分布。腎臟集合管主細(xì)胞管腔側(cè)和胞內(nèi)囊泡內(nèi)主要分布的是AQP2，成為腎臟集合管水代謝的主要載體。多種先天或后天疾病與AQP2異常有關(guān)，在尿液濃縮中對(duì)水的重吸收有重要作用〔13〕。研究梗阻性黃疸時(shí)AQP表達(dá)變化，有利于明確梗阻性黃疸時(shí)腎損傷部位、程度，還可對(duì)損傷機(jī)制進(jìn)行探討。AQP2表達(dá)減少的同時(shí)發(fā)現(xiàn)腎集合管細(xì)胞改變，從而使腎集合管水的重吸收和尿的濃縮功能受到影響，造成腎功能損害〔14〕。在這個(gè)時(shí)期加以預(yù)防，可以大大降低梗阻性黃疸圍術(shù)期腎衰竭發(fā)生。因此AQP2可作為腎功能損害早期檢測(cè)指標(biāo)〔15〕。

ET-1對(duì)腎臟水鈉調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確。部分學(xué)者認(rèn)為：ET-1作為局部激素(腎內(nèi))的主要作用是利尿利鈉〔16，17〕。影響髓袢、集合管對(duì)尿液的濃縮功能〔18〕。研究表明在ET-1增高時(shí)，除了造成集合管細(xì)胞Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管內(nèi)Ca2+增多，影響細(xì)胞代謝，加速細(xì)胞壞死以外，還影響腎小球血流動(dòng)力學(xué)〔19〕。實(shí)驗(yàn)證實(shí)梗阻性黃疸大鼠早期尿量增加，且其不隨入液量的減少而減少〔20〕。梗阻性黃疸早期尿濃縮功能下降的重要因素之一就是腎髓質(zhì)ET-1水平的升高，使已減少的體液量進(jìn)一步喪失，從而進(jìn)一步加重了腎功能損害。目前還無(wú)法確定AQP2的減少就是由于ET-1的增加而導(dǎo)致。從ET-1的損傷機(jī)制看，由于它直接作用于腎臟集合管細(xì)胞，使其Na+-K+-ATP酶泵失活，使集合管內(nèi)Ca2+增多，影響細(xì)胞代謝，加速細(xì)胞壞死?？赡苁茿QP2減少的原因?？稍诠Ｗ栊渣S疸時(shí)阻斷ET-1的增加，從而觀察AQP2表達(dá)變化以進(jìn)一步證實(shí)。

4 參考文獻(xiàn)

1王文光，范兆陽(yáng)，景光遠(yuǎn),等.AQP1、AQP2和AQP3在人膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)及其意義〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012;37(5)：405-8.

2王 勇，劉金鋼，宋 軍，等.生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠梗阻性黃疸腸菌移位的影響〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2002;19(1)：85.

3劉金鋼，王 勇，宋 軍，等.生長(zhǎng)激素對(duì)實(shí)驗(yàn)性梗阻性黃疸大鼠內(nèi)毒素血癥的防治〔J〕.中華普通外科雜志，2001；16(8)：493-4.

4King LS，Kozono D，Agre P.From structure to disease：the evolving tale of aquporin biology〔J〕.Nature Reviews Mol Cell Biol，2004；5(9)：687-98.

5Cheng CY，Chu JY，Chow BK.Vasopressin-independent mechanisms in controlling water hemeostasis〔J〕.J Mol Endocrinol，2009;43(3)：81-92.

6Bouley R，Lu HA，Nunes P，etal. Calcitonin has a vasopressin-like effect on aquaporin-2 trafficking and urinary concentration〔J〕.J Am Soc Nephrol，2011;22(1)：59-72.

7柏 楠，藺錫侯，王 宇，等.梗阻性黃疸大鼠血漿和腎組織內(nèi)皮素含量的變化及與腎功能關(guān)系的研究〔J〕.中華肝膽外科雜志，2002;4(4)：228-31.

8Agre P,Preston GM. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family〔J〕. Proc Natl Acad Sci U S A,1991;88(24):11110-4.

9Sui H，Han BG，Lee JK，etal.Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel〔J〕.Nature，2001；414(6866)：872-8.

10Procino G，Barbieri C，Carmosino M，etal. Fluvastatin modulates renal water reabsorption in vivo through increased AQP2 availability at the apical plasma membrane of collecting duct cells〔J〕.Pflugers Arch，2011;462(5)：753-66.

11穆 鑫，康 白.水通道蛋白與糖尿病腎病〔J〕.國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2006;26(2)：32-4.

12Gong H，Wang WD，Tae Hwan K，etal.Reduced renal expression of AQP2，P-AQP2 and AQP3 in hemorrhagic shock-induced acute renal failure〔J〕.Nephrology Dial Transplant,2003;18：2551-9.

13Kakiashvili E，Speight P，Waheed F，etal.GEF-H1 mediates tumor necrosis factor-alpha-induced Rho activation and myosin phosphorylation：role in the regulation of tubular paracellular permeability〔J〕.J Biol Chem，2009;284(17)：11454-66.

14Klokkers J，Langehanenberg P，Kemper B，etal. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2009;297(3)：F693-703.

15孟項(xiàng)真，劉金鋼，王 勇，等.膽道梗阻解除術(shù)后腎水通道蛋白2表達(dá)變化的試驗(yàn)研究〔J〕.肝膽胰外科雜志，2008;20(2)：80-4.

16崔文瑤，王昆鵬，宋 濤,等.內(nèi)毒素血癥大鼠腎臟水通道蛋白2等基因表達(dá)及腎臟結(jié)構(gòu)功能的改變〔J〕.天津醫(yī)藥，2011;39(9)：817-9.

17Boone M，Kortenoeven M，Robben JH，etal. Effect of the cGMP pathway on AQP2 expression and translocation：potentialimplications for nephrogenic diabetes insipidus〔J〕. Nephrol Dial Transplant，2010;25(1)：48-54.

18Kasono K，Saib T，Tamemob H，etal.Hypertionicity regulates the aquaporin-2 promoter independently of arginine vasopressin〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2005;20(3)：509-15.

19Yang L，Yang XC，Yang JK，etal.Cytosporin A suppresses proliferation of endo the lial progenitor cells，involvement of nitric oxide synthase inhibition 〔J〕. Int Med，2008;47(16)：1457-64.

20Kramer HJ，Schwarting K，Backer A，etal.Renal endothelin-1 system in obstructive jaundice：its role in impaired renal function of bile-duct ligated rats〔J〕.Clin Sci，1997;92(6)：579-85.