依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腦缺血后丘腦微血管密度、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

朱 江 周志強(qiáng) 竇志杰 孫艷軍 張曉璇 邱海鵬

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可以明顯促進(jìn)缺血后神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)發(fā)育，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)元損傷后再生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用〔1〕。依達(dá)拉奉是一種新型腦保護(hù)劑，通過捕獲羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用〔2〕,抑制腦細(xì)胞的過氧化作用和延遲神經(jīng)元死亡，減輕腦缺血、腦水腫和組織損傷〔3〕。本研究探討依達(dá)拉奉在腦缺血過程中起到的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 Wistar成年健康雄性大鼠220～240 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，治療組，缺血對(duì)照組；按時(shí)間點(diǎn)又分為7、14 d兩個(gè)亞組，其中假手術(shù)組每個(gè)亞組6只，其余每個(gè)亞組12只大鼠。

1.2腦缺血模型制備 結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出的雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動(dòng)脈：大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入右側(cè)橫突孔內(nèi)凝閉椎動(dòng)脈3～4 s，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈及右側(cè)椎動(dòng)脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對(duì)照組均在阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈及右側(cè)椎動(dòng)脈后立即開始治療。治療組每天腹腔注射依達(dá)拉奉2次，時(shí)間間隔12 h，每次注射劑量按3 mg/kg計(jì)算。缺血對(duì)照組每天腹腔注射生理鹽水2次，時(shí)間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。治療組及缺血對(duì)照組均在術(shù)后7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取丘腦腦組織。

1.4實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 應(yīng)用10%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時(shí)用眼科剪剪破右心耳，此時(shí)血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸鹽緩沖液配成，pH7.4)灌流固定。灌流結(jié)束后取出腦組織，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.5觀察指標(biāo) ①微血管密度。②神經(jīng)營養(yǎng)因子：NGF、BDNF蛋白表達(dá)測(cè)定用SP免疫組織化學(xué)染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設(shè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照用PBS替代一抗孵育切片。結(jié)果判定：陽性細(xì)胞的胞質(zhì)、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析：采用Simple PCI-8圖像分析軟件。每只大鼠取3張切片，每張切片在光鏡下選5個(gè)視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級(jí)為0～256灰級(jí)，平均灰度表示陽性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級(jí)越高，說明反應(yīng)強(qiáng)度越低。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織中NGF、BDNF灰度值的變化 治療組及缺血對(duì)照組灰度值較假手術(shù)組顯著增加，治療組NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血對(duì)照組。見表1、表2。

2.2各組腦組織中微血管灰度的變化 治療組及缺血對(duì)照組的微血管灰度值較假手術(shù)組均增加，治療組增加的幅度低于缺血對(duì)照組。見表3。

表1 各組大鼠腦組織NGF蛋白陽性表達(dá)比較±s)

表2 各組大鼠腦組織BDNF蛋白陽性表達(dá)比較±s)

表3 各組大鼠腦組織微血管灰度值比較±s)

3 討 論

BDNF和NGF是神經(jīng)營養(yǎng)素家族中的重要組成部分，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和其他中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)是有效的生長(zhǎng)因子〔4〕。BDNF和NGF主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成。這些可溶性蛋白因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對(duì)神經(jīng)元生存、分化、生長(zhǎng)和維持神經(jīng)元正常生理功能等發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5,6〕，能抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元再生、塑形和與神經(jīng)相關(guān)酶的合成。

神經(jīng)元與分布在其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、微血管及其相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子共同構(gòu)成神經(jīng)元單元。神經(jīng)元單元之間相互聯(lián)系，共同構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。腦缺血后出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量及微血管密度減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，引起局部微循環(huán)障礙，即微血管凋亡的數(shù)量大于其新生的數(shù)量。微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被破壞，為重新建立這種平衡，神經(jīng)元單元需要再生，在微環(huán)境再生中神經(jīng)營養(yǎng)素家族發(fā)揮重要的作用。研究表明，腦缺血后BDNF、NGF表達(dá)增加〔7〕，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，增強(qiáng)抗氧化酶活性，減輕自由基損傷；抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)蛋白酶活性；修復(fù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生機(jī)制〔8，9〕，重新建立內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

本研究充分利用依達(dá)拉奉通過血腦屏障，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕腦組織花生四烯酸引起的腦水腫，縮小缺血半暗帶的面積，防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等有效藥理作用，進(jìn)一步提高BDNF、NGF表達(dá)，從而增加新生血管的密度。

本研究發(fā)現(xiàn)，提示依達(dá)拉奉通過清除自由基促進(jìn)了神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，起到了對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。同時(shí)，進(jìn)一步促進(jìn)微血管密度增加，使得部分神經(jīng)元單元得以修復(fù)完善，進(jìn)而達(dá)到維護(hù)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的目的。

4 參考文獻(xiàn)

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