穴位埋線對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及血清白介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達的影響

唐中生 謝高宇 陸 瑩 陳 波 張作濤 羅亞非

(貴陽中醫(yī)學院解剖學教研室,貴州 貴陽 550002)

血管性癡呆(VD)是導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征〔1〕。腦缺血再灌注損傷的過程中腦內(nèi)氧自由基、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等有毒代謝產(chǎn)物增多，對腦組織具有明顯的損傷作用，能引起一系列的炎癥因子表達使炎性細胞浸潤，進而加重神經(jīng)元的損傷〔2〕。缺血與再灌注早期產(chǎn)生的黏附分子和細胞因子構(gòu)成了缺血性炎性損傷的基礎(chǔ)〔3〕。以白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α為代表的細胞因子在腦缺血后的炎性反應中扮演著啟動因素的角色，且在發(fā)病后數(shù)天至1 w內(nèi)占主導作用〔4〕。為探討VD發(fā)病與血清IL-1β與TNF-α的關(guān)系，本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠學習記憶能力的變化、海馬神經(jīng)元損傷減緩及血清IL-1β與TNF-α水平，探討穴位埋線治療VD的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級，由重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，許可證號：SCXK(渝)2007-0006。

1.2實驗器材 可吸收性外科縫線(經(jīng)絡疏通專用線)(中國中醫(yī)研究院眾益科技開發(fā)公司)，電子天平(蘇州精密儀器廠)；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；微型動脈夾(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術(shù)器械廠)；一次性2.5 ml的注射針頭(江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)。

1.3藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、IL-1β(美國R&D Systems 公司生產(chǎn))、TNF-α檢測試劑盒(貴州平生生物技術(shù)有限公司提供)；尼莫地平片(正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0801002)。

1.4VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立VD大鼠模型〔5〕。模型制作成功標準：大鼠在4條血管阻斷后1～2 min內(nèi)，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.5治療方法 術(shù)后第7天開始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進行，每日1次，連續(xù)治療15 d。①穴位埋線組。穴位選擇：百會、膈俞、氣海、三陰交、膻中。 穴位定位：以《實驗針灸學》定位位置為標準〔6〕。治療方法：將可吸收性外科縫線(4～0號)剪成1 cm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時用鑷子將其裝入2.5 ml的注射針頭，然后再將預先剪去針尖的6.7 cm針灸針作為針芯穿入注射針頭內(nèi)，組成一套埋線工具。埋線時，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內(nèi)的羊腸線推入穴內(nèi)，感覺注射針內(nèi)有空虛感時方可出針，并確認羊腸線已埋入穴位內(nèi)。②尼莫地平組。按20 mg·kg-1·d-1的用量進行灌胃治療。假手術(shù)組、模型組均給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃。

1.6Morris 水迷宮學習記憶能力檢測〔7〕術(shù)后第28天開始水迷宮測試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(24±2)℃，池壁上4個等距離點分水池為4個象限，選第3象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。第1～6天進行定向航行實驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(各象限水池壁中點)靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期；第7天行空間探索實驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數(shù)。

1.7血清采集及檢測 Morris 水迷宮檢測之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股動脈采集血液，入冰箱靜置過夜后采集血清以備進行IL-1β與TNF-α含量檢測。開顱取腦，取海馬組織固定12 h。經(jīng)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm)用Biomias99圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。HE染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1穴位埋線對VD大鼠Morris水迷宮的影響 定位航行實驗：平均逃避潛伏期反映大鼠的學習能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長(P<0.05，P<0.01)，穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)，與尼莫地平組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

空間探索實驗：該實驗反映了大鼠的記憶能力。模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數(shù)減少(P<0.01)，穴位埋線組與模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數(shù)增多(P<0.01，P<0.05)，穴位埋線組與尼莫地平組無比較意義(P>0.05)。見表2。

2.2穴位埋線對VD大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的影響 模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，穴位埋線組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量雖然也高于假手術(shù)組(P<0.05)，但與模型組大鼠相比明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3穴位埋線對VD大鼠病理形態(tài)學的影響 圖1可見，HE染色見假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無變性、壞死和腫脹細胞結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)豐富，無膠質(zhì)細胞增生現(xiàn)象；細胞核呈圓形、橢圓形。模型組海馬組織明顯水腫，血管擴張充血，神經(jīng)元嚴重腫脹、變性及排列紊亂，并嚴重壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。穴位埋線組海馬CA1區(qū)未出現(xiàn)水腫、見輕微血管擴張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)輕微腫脹，未見變性、排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴張充血，神經(jīng)元輕微腫脹和變性、無壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。

表1 各組大鼠每天平均逃避潛伏期的測試±s)

表2 各組大鼠空間探索實驗第Ⅲ象限活動時間、穿越站臺次數(shù)及血清IL-1β、TNF-α含量±s)

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理形態(tài)學觀察(HE，×400)

3 討 論

研究表明，不完全的缺血性損傷、局部及遠處的缺血性改變等都與VD有關(guān)〔8〕。腦血流中斷和再灌注導致腦細胞壞死或凋亡，反復、多次缺血性腦血管事件發(fā)作可誘發(fā)認知功能障礙和相關(guān)腦血管病的神經(jīng)功能障礙。研究表明，炎癥反應在慢性腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起主要作用〔9〕。腦缺血發(fā)生后，血漿及腦組織TNF-α、IL-1β含量均出現(xiàn)變化，并且隨時間變化而變化。IL-1β是一種具有多效性作用的促炎性細胞因子，是啟動炎癥反應的關(guān)鍵細胞因子之一，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。IL-1β通過誘導白細胞黏附，介導白細胞向缺血腦組織浸潤，引起腦組織炎癥反應，導致腦組織進一步損傷。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞分泌。在腦缺血再灌注后，TNF-α是最早產(chǎn)生并發(fā)揮作用的促炎細胞因子，是炎癥反應的始動因素，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因，它具有增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，誘導細胞黏附因子表達等作用。以IL-1β與TNF-α為代表的炎性細胞因子參與許多神經(jīng)病理過程，包括腦缺血引起急性神經(jīng)變性、老年性癡呆(AD)等慢性神經(jīng)變性。無論是炎性細胞因子過度表達，還是其誘發(fā)的其他活性物質(zhì)的過度表達，都將使反應向不利于機體的方向發(fā)展。這些炎癥細胞因子在健康成人腦內(nèi)含量很低，只有在伴發(fā)炎癥及免疫反應的病理情況下才明顯表達增多。IL-1β及TNF-α在腦缺血再灌注損傷引起的炎癥級聯(lián)反應中起主要介導作用，體針針刺可抑制炎性細胞因子IL-1β、TNF-α及其mRNA的表達，從而降低組織或血清中其蛋白的含量〔10〕。大鼠急性腦缺血和再灌注30 min后，血漿IL-1β和TNF-α含量均有不同程度升高，循經(jīng)取穴電針能顯著降低血漿IL-1β、IL-6和TNF-α含量。說明炎性細胞因子及由此介導的炎癥級聯(lián)反應參與缺血再灌注腦損傷過程，電針可通過阻斷炎癥級聯(lián)反應實現(xiàn)對缺血再灌注腦損傷的保護作用〔11〕。

穴位埋線療法在中醫(yī)理論指導下，采用不同型號的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過羊腸線對穴位的持續(xù)刺激作用，達到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應用于臨床各科〔12〕。臨床采用穴位埋線治療VD也取得了一定的效果，但是其治療VD的作用機制還未見報道。中醫(yī)認為，癡呆病人多屬本虛標實，氣滯血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血則可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯雜，致使清竅受蒙，靈機呆鈍而出現(xiàn)神識不清，表情癡呆諸癥。本研究選取百會、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方。百會為諸陽、百脈之會，可開竅醒神、回陽固脫。膈俞有開胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補元氣。三陰交可健脾益氣，調(diào)補肝腎。膻中為氣會，有理肺氣、通乳絡之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實驗以此為基礎(chǔ)，運用穴位埋線治療實驗性VD大鼠，觀察大鼠神經(jīng)元的凋亡變化與埋線治療的療效關(guān)系，提供形態(tài)學依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動物空間學習記憶研究的實驗?？臻g學習記憶是檢測動物空間方向、反射時間、視知覺和結(jié)構(gòu)應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學習記憶，因能較好地檢測到實驗動物的空間學習記憶功能，并有排除動物在完成作業(yè)而經(jīng)過的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對其他動物作業(yè)成績產(chǎn)生影響等優(yōu)點，因而在國內(nèi)外被廣泛采用〔13〕。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠學習記憶能力較對照組明顯減退，應用4-VO改良法成功復制了VD模型大鼠。穴位埋線能有效改善VD大鼠的學習記憶能力。

本研究結(jié)果表明，降低血清IL-1β、TNF-α含量、緩解腦缺血后炎癥反應，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機制之一。

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