補(bǔ)腎活血方對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

許藝惠 葉水芬 王婷婷 蘇幼燕 王華金 吳良寧 蔡 晶

(福建省第二人民醫(yī)院健康管理中心，福建 福州 350003)

血管性癡呆(VD)發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該病也無(wú)有效的治療方法。研究表明，多次腦卒中或長(zhǎng)期慢性腦缺血造成神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激是腦缺血損傷的主要原因之一〔1，2〕。腦缺血等病理情況下氧自由基生產(chǎn)增多，自由基清除酶活性降低，加重了缺血造成的神經(jīng)組織損傷。由于腦組織富含對(duì)自由基敏感的多不飽和脂肪酸，極易被氧化；而且神經(jīng)細(xì)胞的氧自由基清除酶含量較低，故自由基清除能力相對(duì)較弱。因此，神經(jīng)細(xì)胞易受氧化應(yīng)激損傷〔3〕。補(bǔ)腎活血方以補(bǔ)腎活血為立法，方中以淫羊藿溫腎壯陽(yáng)為君藥，配以丹參等活血化瘀藥物。諸藥配合，補(bǔ)中有通，標(biāo)本兼治，在臨床應(yīng)用具有補(bǔ)益脾腎、益智健腦、活血開(kāi)竅之功，常用于治療長(zhǎng)期慢性腦缺血或腦卒中后的記憶力、計(jì)算力、判斷力降低等輕中度VD的智能障礙〔4～10〕，但是相關(guān)機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討補(bǔ)腎活血方對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為VD的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 補(bǔ)腎活血方購(gòu)自福建省第二人民醫(yī)院(含淫羊藿、丹參等)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，H2O2購(gòu)自上海試一化學(xué)試劑有限公司，MTT、DMSO、胰蛋白酶、多聚賴氨酸均購(gòu)自Sigma公司，青/鏈霉素溶液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，ELISA試劑盒購(gòu)自上海瀘峰公司(編號(hào)FA04453B、FA04426B、FA04438B、FA00459B)，β-actin(13E5)Rabbit mAb、Caspase-3 Rabbit mAb、CAT Rabbit mAb均購(gòu)自Cell Signaling公司，GPx-1 Rabbit mAb購(gòu)自Abcam公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄用試劑盒、Green PCR master MIX(2x)均購(gòu)自Fermentas公司，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，DEPC、TBE、MARKER均購(gòu)自Solarbio公司，瓊脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10購(gòu)自SPAIN公司，其他試劑(乙醇、異丙醇、氯仿等均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純)，PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)生命科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2主要儀器 生物倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀XL800為美國(guó)Bio-Tex公司，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、化學(xué)發(fā)光成像儀為BIO-RAD公司，PCR分析儀為Eppendorf公司。H7650型透射電鏡為日立公司、400萬(wàn)像素電鏡CCD相機(jī)為SIS公司。

1.3含藥培養(yǎng)液的制備

1.3.1含H2O2培養(yǎng)液的制備 H2O2經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，用GIBCO DMEM培養(yǎng)基配制成不同濃度的H2O2(終濃度分別為50、100、150、200、300、400、500 μmol/L)，以新鮮配制的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。4 ℃冷藏備用。

1.3.2補(bǔ)腎活血方水提液的制備 精密稱取補(bǔ)腎活血方55 g，10倍量的蒸餾水,浸泡1 h,加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾；第2次再加10倍量的蒸餾水加熱回流提取2 h，趁熱過(guò)濾；合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至10 ml備用，濃度為5.5 g生藥/ml。實(shí)驗(yàn)中所用補(bǔ)腎活血方濃度均以生藥量計(jì)算。

1.3.3補(bǔ)腎活血方醇提液的制備 精密稱取補(bǔ)腎活血方55 g，石油烷脫脂后，用95%的乙醇索氏提取，定容至10 ml備用，濃度為5.5 g生藥/ml。

實(shí)驗(yàn)時(shí)取補(bǔ)腎活血方水提液、醇提液加入DMEM培養(yǎng)基中，在超凈臺(tái)內(nèi)，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃冷藏備用。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用GIBCO DMEM培養(yǎng)液，含10% Hyclone胎牛血清、2%青/鏈霉素溶液配制。在37℃、5 % CO2飽和濕度條件下，每天換液1次，1 w傳代2次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5不同濃度不同時(shí)間H2O2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104/L的濃度接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的H2O2(終濃度分別為50、100、150、200、300、400、500 μmol/L)，以新鮮配制的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后每孔加入5 mg/ml的MTT 溶液20 μl，避光培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加入150 μl的DMSO溶液，振蕩10 min，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(主波長(zhǎng)490 nm，次波長(zhǎng)630 nm)，測(cè)定其吸光值，并計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率/%=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/空白組吸光度均值×100%。

1.6不同濃度補(bǔ)腎活血方對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，分別加入終濃度為200、400、800、1 600 μg/ml的補(bǔ)腎活血方水提液及醇提液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定其吸光值。各組細(xì)胞的存活率計(jì)算方法同1.5。

1.7不同濃度不同時(shí)間補(bǔ)腎活血方對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響 細(xì)胞培養(yǎng)方法同前，分別加入200 μmol/L H2O2，培養(yǎng)24 h后棄上清，分別加入200、400、800、1 600 μg/ml水提液及醇提液，以新鮮配制的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12、24、36、48 h后，測(cè)定其吸光值。各組細(xì)胞的存活率計(jì)算方法同1.5。

1.8分組方法和光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×105/L的濃度細(xì)胞接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后棄上清；正常組加入新鮮培養(yǎng)液，模型組、補(bǔ)腎活血方水提組、補(bǔ)腎活血方醇提組加入200 μmol/L H2O22 ml干預(yù) 24 h；棄上清，正常組、模型組加入新鮮培養(yǎng)液，補(bǔ)腎活血方水提組、補(bǔ)腎活血方醇提組分別加入終濃度800 μg/ml補(bǔ)腎活血方水提液及醇提液，干預(yù)24 h。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.9電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞；1 200 r/min離心8 min，去上清，經(jīng)3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS(7.2)前固定30 min，用細(xì)針沿離心管壁輕劃一圈，使固定液充分滲入底部細(xì)胞團(tuán)，4 ℃靜置固定數(shù)天；0.1 mol/L PBS漂洗并保存過(guò)夜；2%鋨酸-3%亞鐵氰化鉀水溶液后固定2 h；0.1 mol/L PBS漂洗并保存過(guò)午；酒精-丙酮梯度脫水；環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋；超薄切片80 nm，醋酸雙氧鈾/檸檬酸鉛雙染色，日立H7650型透射電鏡80 kV觀察，SIS400萬(wàn)像素電鏡CCD相機(jī)拍攝。

1.10ELLAS法檢測(cè)intracellular SOR、CAT、GPx-1、GSH 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，PBS洗滌2次，置冰袋上，各加入細(xì)胞裂解液300 μl，裂解20 min，收集細(xì)胞于1.5 ml EP管，4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清于一新EP管，得細(xì)胞裂解上清液。按BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白含量。嚴(yán)格按照各項(xiàng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作測(cè)定intracellular SOR含量及CAT、GPx-1、GSH的活性。分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外，37℃溫育30 min。洗板5次。每孔先加入顯色劑A、B各50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值(測(cè)定應(yīng)在15 min以內(nèi)進(jìn)行)。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與吸光值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.11Western印跡檢測(cè)HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3的蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2遍，吸干多余的PBS。置于冰上，每孔加入細(xì)胞裂解液150 μl，以移液槍反復(fù)吹打，裂解30 min。將細(xì)胞收集于1.5 ml的EP管中，14 000 r/min離心30 min，上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中。每組樣品各取20 μl用BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余部分加入1/4體積的5×上樣緩沖液，100℃水浴變性5 min；變性后取相同蛋白量(50 μg)樣品，另1孔分別加入可視Marker 5 μl。恒壓情況下12%SDS-PAGE電泳，100 V電泳80 min。電泳結(jié)束，卸下凝膠，按蛋白質(zhì)Marker找出和目的蛋白分子量相應(yīng)的凝膠位置，切膠，以半干電轉(zhuǎn)移法(電轉(zhuǎn)條件為3.0 mA/cm2轉(zhuǎn)45 min)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下于脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。封閉結(jié)束后，分別加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；再次取出PVDF膜，TBST振搖洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h；將PVDF膜以TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色劑顯色，放置到成像儀內(nèi)，進(jìn)行曝光成像，形成相應(yīng)的蛋白免疫印跡。Image Lab軟件半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參照。目的條帶的光密度積分值V值 (V=平均吸光度值×條帶面積)；計(jì)算V目的條帶/Vβ-actin光密度積分值的比率(Ratio)。

1.12RT-PCR檢測(cè)CAT的基因表達(dá)

1.12.1細(xì)胞總RNA的提取 采用Trizol法抽提：各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，分別加入1 ml冰冷的Trizol，用移液器上下抽吸直到細(xì)胞充分裂解，于室溫放置5 min，加入0.2 ml氯仿，上下顛倒管子混合15 s，冰浴中放置10 min，在4℃條件下以12 000 r/min離心10 min，小心將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混合后，在冰浴中放置10 min。在4℃條件下以12 000 r/min離心10 min，小心并盡可能去除全部上清液。然后用1 ml 75%乙醇洗滌沉淀和管壁，7 500 g/min離心5 min，去除乙醇后將RNA室溫放置干燥5 min，用20 μl無(wú)RNase污染的DEPC水將所提取的RNA溶解。采用1%的變性瓊脂糖電泳、A260∶A280及A260∶A230檢測(cè)所提取RNA的完整性和均一性。

1.12.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 20 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：total RNA 2 μg、Oligo(dT)18 primer 1 μl、5×RB 4 μl、RI(20 U/μl)1 μl、dNTP Mix 2 μl、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl、補(bǔ)去離子水至20 μl體積。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 1 h逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70℃ 5 min滅活M-MLV。

1.12.3PCR反應(yīng) 20 μl的PCR反應(yīng)體系為：PCR Master Mix 10 μl、上游引物和下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、補(bǔ)去離子水至20 μl體積。PCR反應(yīng)條件：CAT、 β-actin (預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s、退火CAT 58℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)數(shù)，最后72℃延伸 10 min)；HO-1、GPX-1(預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃ 1 min、退火HO-1 58℃/GPX-1 65℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共進(jìn)行23個(gè)循環(huán)數(shù)，最后72℃延伸10 min)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl于1.5%瓊脂糖凝膠電泳；EB染色，用圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，作掃描面積積分半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參照。目的條帶的光密度積分值V值 (V=平均吸光度值 ×條帶面積)；計(jì)算V目的條帶/Vβ-actin光密度積分值的比率(Ratio)。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1不同時(shí)間和濃度的H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)圖1。各個(gè)濃度的細(xì)胞存活率均隨時(shí)間有變化(F=158.87，P=0.000)。各濃度細(xì)胞存活率不等，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率均隨濃度有變化(F=823.831，P=0.000)。濃度因素與時(shí)間因素有交互作用，說(shuō)明各濃度組細(xì)胞存活率的時(shí)間變化有差異(F=19.193，P=0.000)。

圖1 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

從濃度上看，12.5、25 μmol/L H2O2在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。50 μmol/L及 以上的細(xì)胞存活率均表現(xiàn)不同程度降低(P<0.05)。

從時(shí)間上看，1、3 h各濃度H2O2的細(xì)胞存活率均在50%以上，6 h及以上(50 μmol/L及 以上)的細(xì)胞存活率濃度均在50%以下，以15、18 h最為顯著(P<0.05)。24 h中12.5、25、50 μmol/L均對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，200 μmol/L及以上濃度的細(xì)胞存活率均為50%以下，故選200 μmol/L H2O2干預(yù)24 h作為造模條件。

2.2不同濃度的補(bǔ)腎活血方對(duì)細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)圖2。單獨(dú)用200、400、800、1 600 μg/ml的補(bǔ)腎活血方水提液與補(bǔ)腎活血方醇提液干預(yù)24 h，對(duì)PC12細(xì)胞存活率無(wú)毒性作用。

2.3不同時(shí)間不同濃度補(bǔ)腎活血方對(duì)H2O2損傷的細(xì)胞存活率的影響 見(jiàn)圖3。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率不等，即各個(gè)濃度的細(xì)胞存活率均隨時(shí)間有變化(F=21.125，P=0.000)。各濃度細(xì)胞存活率不等，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率均隨濃度有變化(F=64.891，P=0.000)。從組別因素上看，兩組細(xì)胞存活率不等(F=14.447,P=0.000)。濃度因素與時(shí)間因素有交互作用，說(shuō)明各濃度組細(xì)胞存活率的時(shí)間變化有差異(F=2.328，P=0.000)。

圖2 補(bǔ)腎活血方對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

圖3 補(bǔ)腎活血方對(duì)H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，提示H2O2能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷。給予不同濃度補(bǔ)腎活血方水提、醇提液干預(yù)3、6、12、24、36、48 h后，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，表明補(bǔ)腎活血方能顯著降低H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。且800 μg/ml干預(yù)24 h較明顯，故選用800 μg/ml干預(yù)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4光鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化(圖4)。結(jié)果表明正常對(duì)照組PC12細(xì)胞呈神經(jīng)元突起形態(tài)，模型組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；補(bǔ)腎活血方水提組及補(bǔ)腎活血方醇提組細(xì)胞形態(tài)基本正常。

2.5電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化 正常組：細(xì)胞大多近圓形或橢圓形，微絨毛樣突起多；膜未見(jiàn)破裂或細(xì)胞腫脹；核居中大而圓見(jiàn)單個(gè)核仁，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)散在；偶見(jiàn)偏位較小呈腎形。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體呈短棒狀，較小，較多，散在分布；可見(jiàn)較多嵴，未見(jiàn)明顯斷裂或消失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈單條扁囊狀，量中等，散在分布，未見(jiàn)脫顆?，F(xiàn)象。模型組：細(xì)胞球形，微絨毛樣突起明顯減少。核多見(jiàn)偏位，異形，明顯縮??；偶見(jiàn)居中橢圓，略?。怀Ｈ旧|(zhì)多，異染色質(zhì)散在。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)受損線粒體多見(jiàn)，呈空泡樣，或腫脹的線粒體可見(jiàn)少量嵴，嵴斷裂或消失；見(jiàn)少量固縮線粒體與溶酶體融合；溶酶體增大增多，電子密度增高，形狀不一；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為單個(gè)扁平囊，部分囊泡化，或脫顆粒，散在。補(bǔ)腎活血方水提組：細(xì)胞球形或橢圓形，細(xì)胞表面可見(jiàn)微絨毛樣突起。細(xì)胞核近中部，大而橢圓，常見(jiàn)核仁，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)散在；偶見(jiàn)偏位較小呈腎形。大部分細(xì)胞線粒體基本正常，偶見(jiàn)線粒體水腫，嵴可見(jiàn)。溶酶體可見(jiàn)，數(shù)量不等。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為單條扁平囊，散在，未見(jiàn)明顯水腫，部分脫顆粒。補(bǔ)腎活血方醇提組：細(xì)胞球形或橢圓形，細(xì)胞表面可見(jiàn)微絨毛樣突起。核近居中橢圓，或偏位，略小，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)散在。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體卵圓形或短棒狀，結(jié)構(gòu)基本正常。溶酶體可見(jiàn)，數(shù)量不等。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為單條扁平囊，散在，未見(jiàn)水腫或脫顆粒。見(jiàn)圖5。

圖4 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 (×200)

圖5 電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化(×15 000)

2.6ELISA法檢測(cè)抗氧化酶的活力 與正常組比較，模型組細(xì)胞中SOR含量顯著增多，CAT、GPx-1、GSH的活力均有顯著下降；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方組細(xì)胞中SOR含量顯著減少，CAT、GPx-1、GSH的活力均有顯著提高，且醇提組較為明顯；以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.7Western 印跡檢測(cè)HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3的蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組細(xì)胞中CAT表達(dá)稍下調(diào)，HO-1、GPx-1表達(dá)明顯下調(diào)，Caspase-3表達(dá)顯著增高；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方組HO-1、CAT、GPx-1表達(dá)上調(diào)，Caspase-3表達(dá)下調(diào)，且醇提組略明顯(P<0.05)(見(jiàn)表3，圖6)。

表2 補(bǔ)腎活血方對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響±s)

表3 補(bǔ)腎活血方對(duì)HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響±s，n=6)

2.8RT-PCR檢測(cè)HO-1、CAT、GPx-1的基因表達(dá) 與正常組(0.22、0.15、1.44)比較，模型組細(xì)胞中HO-1、CAT、GPx-1基因的表達(dá)水平(0.05、0.07、1.00)下調(diào)；與模型組比較，補(bǔ)腎活血方水提組HO-1、CAT、GPx-1基因的表達(dá)水平(0.12、0.08、1.60)上調(diào)，醇提組上調(diào)更明顯(0.21、0.17、1.75)(P<0.05) 。見(jiàn)圖7。

圖6 補(bǔ)腎活血方對(duì)HO-1、CAT、GPx-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖7 補(bǔ)腎活血方對(duì)HO-1、CAT、GPx-1、基因表達(dá)的影響

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精，精生髓上充于腦”。腎精充足上充腦髓，則神機(jī)精靈；若腎精匱乏腦髓空虛，則神呆智鈍。補(bǔ)腎中藥有固精益腎的作用，是臨床常用的健腦益髓藥物。補(bǔ)腎活血方以補(bǔ)腎活血為立法，通過(guò)臨床用藥的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合本課題組前期對(duì)淫羊藿等多種單味補(bǔ)腎中藥的研究〔4，5〕，以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道肉蓯蓉、黃精、丹參酮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用〔6～8〕，選擇效果較好的3種補(bǔ)腎中藥加上活血化瘀藥組成。方中以肉蓯蓉為君藥，取其補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血的陰陽(yáng)雙補(bǔ)功效；淫羊藿溫補(bǔ)腎陽(yáng)，配合肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽(yáng)，為臣藥；制黃精滋補(bǔ)腎陰，以求陰中求陽(yáng)；丹參活血化瘀，既祛瘀血，又令諸補(bǔ)益藥滋而不膩，同為佐藥。諸藥配合，補(bǔ)中有通，標(biāo)本兼治，具有補(bǔ)益脾腎、益智健腦、活血開(kāi)竅之功。

近年研究表明VD與氧化應(yīng)激和氧自由基損傷、線粒體失能有密切的關(guān)系。H2O2能產(chǎn)生大量氧自由基引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，常用于誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。它可導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，改變胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分和活力，最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷〔11〕。

本研究發(fā)現(xiàn)在同一濃度，H2O2處理時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞存活率越低；在一定濃度范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度增高，細(xì)胞存活率逐漸降低。這與以往的研究一致〔12〕，表明H2O2確實(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，且具有濃度和時(shí)間依賴性。

血紅素加氧酶(HO)可催化產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化碳(CO)，對(duì)減輕氧化損傷具有重要意義。其中HO-1是誘導(dǎo)型，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導(dǎo)產(chǎn)生，通過(guò)加強(qiáng)降解血紅素、膽紅素等產(chǎn)生CO，參與調(diào)節(jié)機(jī)體病理狀態(tài)的多種反應(yīng)〔13〕。超氧化物歧化酶是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要防御系統(tǒng)，其中包括CAT、GPx-1和GSH等，可催化或清除H2O2，避免產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的·OH。谷胱甘肽與其他巰基化合物還可以保持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，從而抑制氧化損傷〔14〕。

在缺氧環(huán)境中，組織內(nèi)氧自由基增多，代謝紊亂，引起細(xì)胞損傷,相關(guān)的抗氧化酶減少，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3可被激活〔15～18〕。Liu 等〔19〕用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞存活率及SOD、CAT、GPx-1等的活性顯著下降，Caspase-3活性顯著升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示補(bǔ)腎活血方通過(guò)提高抗氧化酶的活性發(fā)揮其對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的拮抗作用。

Solaleh等〔20〕用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，藥物干預(yù)組HO-1、GPx-1等蛋白表達(dá)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)中，藥物干預(yù)組HO-1、CAT、GPx-1蛋白表達(dá)。這與以往研究一致，提示其神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。Omotayo等〔21〕用大鼠研究腎氧化應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)藥物組CAT、GPx-1 mRNA表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)腎活血方組HO-1、CAT、GPx-1 mRNA表達(dá)。這與以往研究一致，提示補(bǔ)腎活血方可能通過(guò)提高抗氧化酶的基因表達(dá)減輕氧化損傷。Siddiqui等〔22〕用4-羥基壬烯酸誘導(dǎo)PC12產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)升高。Zhou等〔23〕用活性氧誘導(dǎo)PC12損傷，藥物干預(yù)組通過(guò)降低Caspase-3和Bax的表達(dá)減輕氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)腎活血方組中Caspase-3蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)降低，這與以往研究一致。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方能夠提高H2O2損傷后的細(xì)胞存活率；明顯減輕H2O2引起的細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；減少SOR含量，提高HO-1、CAT、GSH、GPx-1等抗氧化酶的活性，降低Caspases-3的活性。

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