雀啄回旋灸十二背俞穴對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨力學(xué)及骨代謝的影響

張紅石 劉興山 閆 力 姚 新

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

骨質(zhì)疏松是一種常見(jiàn)的骨代謝障礙性疾病，中醫(yī)把其歸為“痿證”“骨痹”、“骨枯”等范疇，認(rèn)為與腎虛、脾虛、肝腎不足有關(guān)〔1〕。本病多見(jiàn)老年人尤其是絕經(jīng)期婦女。據(jù)統(tǒng)計(jì)老年絕經(jīng)后婦女每 3～4人中至少有1 人有一節(jié)椎骨畸形〔2〕。因此本病的預(yù)防十分重要。灸法古稱灸焫，是中國(guó)常用的一種傳統(tǒng)康復(fù)保健手法〔3〕。筆者自創(chuàng)“雀啄回旋灸”保健灸法，通過(guò)對(duì)去卵巢大鼠進(jìn)行骨密度檢測(cè)、血清骨堿性磷酸酶(B-ALP)、尿羥脯氨酸(HYP)檢測(cè)和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)，來(lái)觀察其對(duì)骨質(zhì)疏松的保健作用，為降低骨質(zhì)疏松發(fā)生率、推遲骨形態(tài)改變，提供一種可靠的中醫(yī)康復(fù)保健方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8月齡雌性未孕Wistar大鼠50只，體重280～320 g，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2011-0007，質(zhì)量檢測(cè)單位為吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心。

1.2主要實(shí)驗(yàn)藥品 碘伏(絡(luò)合碘)：山東利爾康消毒科技有限公司，批號(hào)：120130。戊巴比妥鈉：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝，批號(hào)：860122。青霉素：華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020655，批號(hào)：x1210316。苯甲酸雌二醇注射液：天津金耀氨基酸有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H12020529，批號(hào)：1210291。B-ALP試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司。HYP測(cè)試盒(A030-2)：南京建成生物工程研究所。

1.3主要實(shí)驗(yàn)器材 艾灸條：在北京錦城科技發(fā)展有限公司產(chǎn)Q/CYTXK002-2009溫灸純艾條基礎(chǔ)上自制直徑0.5 cm、長(zhǎng)10 cm艾條。骨密度測(cè)量?jī)x(Computerised Bone Minexalometry)：意大利產(chǎn)，型號(hào)：Ⅱb(93/42/CEE)。半自動(dòng)生化分析儀：山東高密度彩虹分析儀器有限公司，型號(hào)：GF-D800。分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：722S。自動(dòng)控制電子萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)：日產(chǎn)，型號(hào)：島津AG-10TA。50 mm讀數(shù)顯微鏡：長(zhǎng)春第三光學(xué)儀器廠制造。扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)機(jī)：TNH3型，長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所制造，TESTTY Force:3 000 cmKg。自凝牙托粉：100 g，哈爾濱市齒科器材廠生產(chǎn)，黑醫(yī)械簽字(91)第2630140號(hào)。自凝牙托水：500 ml，哈爾濱市齒科器材廠，國(guó)藥管械(準(zhǔn)字)2002第3630022號(hào)。聚羧酸鋅水門汀，25 ml，青浦尼康齒科器械廠，采用標(biāo)準(zhǔn) YY0271-1995，注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(試)字 2013第3050032號(hào)。大鼠骨拉伸卡具(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將雌性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分五組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余四組做去卵巢手術(shù)。傷口愈合后，再對(duì)去卵巢大鼠隨機(jī)分為模型組、艾灸組、艾灸加雌激素組、雌激素組。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 模型組、艾灸組、艾灸加雌激素組、雌激素組共40只大鼠，腹部備皮、消毒、在下腹正中沿腹中線做2 cm左右切口，剪開(kāi)肌層，找到子宮，沿子宮找到粉紅色卵巢，節(jié)扎切除。假手術(shù)組(10只)只剪去卵巢周圍脂肪組織，保留卵巢。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，禁食12 h。腹腔注青霉素0.2～0.3 ml/d，連續(xù)10 d，防止感染。

1.4.3艾灸干預(yù) 采用雀啄灸與回旋灸相結(jié)合的方法?；匦脑诰嗥っ? cm處，雀啄灸在距皮毛高5～1 cm范圍內(nèi)。穴位按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠的常用穴位定位〔4〕。分別在足太陽(yáng)膀胱經(jīng)第一側(cè)線的肺俞、厥陰俞、心俞、肝俞、膽俞、脾俞、胃俞、三焦俞、腎俞、大腸俞、小腸俞、膀胱俞由左向右順時(shí)針行回旋灸9圈后，再在脾俞、腎俞、心俞各行9次神雀點(diǎn)頭。反復(fù)至30 min止。施灸時(shí)間在大鼠造模后10 d(傷口愈合)后進(jìn)行。1次/d，連續(xù)90 d。

1.4.4雌激素治療 采用三角肌肌肉注射，藥物為苯甲酸雌二醇，按0.3 mg/kg (70 kg人用量的21倍)給藥，2次/w，共治療12 w〔5～8〕。

1.5骨力學(xué)檢測(cè)

1.5.1骨組織的保存與取材 大鼠處死后，取其四肢骨，編號(hào)后用生理鹽水浸透的紗布包裹(骨組織為黏彈性材料，須保證試樣水分不流失，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，貯存于-20℃冰箱內(nèi)保存。實(shí)驗(yàn)前從冰箱中取出，常溫下解凍，去除軟組織，進(jìn)行力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn) 在電子萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)上完成，測(cè)試大鼠右側(cè)肱骨。實(shí)驗(yàn)機(jī)設(shè)值為傳感器最大量程：200 N；使用量程：200 N；撓度最大量程：2 mm；支座跨距：12.5 mm；加載速度：2 mm/min。反復(fù)加載10次，調(diào)試機(jī)器之后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。試樣斷裂后，用毫米度數(shù)顯微測(cè)量其斷面的面積。根據(jù)所得數(shù)據(jù)及截面幾何尺寸計(jì)算三點(diǎn)彎曲力學(xué)數(shù)據(jù)。截面慣性矩J=3.14(BH3-bh3)/6；截面模量 W=3.14(BH3-bh3)/32H；彎矩 Mmax=PmaxL/4(Nmm)；極限強(qiáng)度 max=Mmax/W(N/mm2)。公式B、H、b、h 分別為試樣空心橢圓截面的內(nèi)外長(zhǎng)短軸直徑(mm)。L為支座跨度(mm)、Pmax為最大載荷(N)。

1.5.3扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 在扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)機(jī)上完成，取其左側(cè)股骨，以牙托粉固定試樣兩端，過(guò)夜自凝。將樣本固定在扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)機(jī)夾頭內(nèi)，驅(qū)動(dòng)機(jī)器對(duì)試樣緩慢施加扭矩，直至斷裂為止，扭矩通過(guò)試驗(yàn)機(jī)測(cè)扭矩度盤(pán)讀出，扭轉(zhuǎn)角通過(guò)光電編碼器讀出。

1.5.4拉伸實(shí)驗(yàn) 在電子萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)上完成，取大鼠左側(cè)肱骨，解凍后兩端用鼠用掐具掐緊裝機(jī)，實(shí)驗(yàn)機(jī)兩端以5 m/min的速度拉伸，當(dāng)肱骨斷裂后自動(dòng)停機(jī)，并打出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和曲線。

1.5.6骨密度檢測(cè) 在大鼠麻醉狀態(tài)下利用雙能骨密度儀測(cè)量，儀器設(shè)定參數(shù)為步距0.5 mm×0.5 mm，掃描速度30 mm/s。測(cè)量部位為右側(cè)股骨。測(cè)量時(shí)間在治療后處死前完成。

1.5.7骨代謝檢測(cè) 血清B-ALP：在大鼠麻醉剖腹，找到腹主動(dòng)脈，插管取血5 ml，3 000 r/min離心15 min，用移液器吸取血清，移入已備好的EP管中，標(biāo)記后放置于低溫冰箱(-30℃)中保存，避免反復(fù)凍融，待標(biāo)本收集齊后統(tǒng)一測(cè)試。按血清骨堿性磷酸酶試劑盒步驟完成，采用國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)(IFCC)推薦法檢測(cè)。HYP：在大鼠禁食24 h后，利用代謝收集籠收集獨(dú)籠飼養(yǎng)24 h大鼠全尿，記錄尿量。按尿HYP試劑盒步驟完成檢測(cè)，采用樣本水解法測(cè)定〔9〕。

2 結(jié) 果

2.1骨力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 模型組與艾灸組、艾灸加雌激素組、雌激素組比較差異顯著(P<0.05或0.01)。模型組與假手術(shù)組比較部分?jǐn)?shù)值有顯著性差異(P<0.05或0.01)。見(jiàn)表1～表3。

表1 三點(diǎn)彎屈實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較(n=10,±s)

表2 扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較(n=10，±s)

表3 拉伸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較(n=10，±s)

2.2骨密度及血清骨堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中模型組與其他組比較骨密度差異顯著(P<0.05)，證明艾灸組、艾灸加雌組、雌激素組均延緩了骨鈣丟失速度變緩。去卵巢各組B-ALP含量均增加，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)，表明在骨礦丟失后，機(jī)體為彌補(bǔ)骨鈣丟失，成骨細(xì)胞表現(xiàn)活躍。模型組與雌激素、艾灸、艾灸加雌激素組比較B-ALP含量差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 骨密度和B-ALP含量比較(n=10，±s)

2.3尿HYP檢測(cè)結(jié)果 在各組去卵巢早期，尿中HYP含量明顯增高，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)，證明骨膠原開(kāi)始丟失。在艾灸、雌激素干預(yù)90 d后，模型組與其他組比較差異顯著(P<0.05)，證明干預(yù)手段有效地緩解了骨膠原的丟失。見(jiàn)表5。

表5 各組尿HYP水平比較(n=10，±s，μg/ml)

3 討 論

骨質(zhì)疏松是常見(jiàn)的老年慢性骨代謝障礙疾病，多發(fā)于絕經(jīng)期婦女〔10〕。筆者在多年對(duì)骨質(zhì)疏松針刺研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)針刺可以增強(qiáng)骨力學(xué)特性〔11〕，延緩鈣丟失〔12〕，增強(qiáng)骨膠原蛋白活性〔13〕、降低白細(xì)胞介素(IL)-6活性〔14〕。但目前尚缺乏一種可以使已疏松的骨組織恢復(fù)到原有狀態(tài)的干預(yù)方法，因此本病的研究更應(yīng)轉(zhuǎn)向保健預(yù)防。筆者自創(chuàng)“雀啄回旋灸十二背俞穴”的保健灸法，根據(jù)中醫(yī)“整體觀念”和“治未病”理念，從臟腑、氣血、八綱等多角度，通過(guò)骨代謝和骨形態(tài)劑量學(xué)檢測(cè)觀察該保健灸法對(duì)絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松的干預(yù)效果。把“十二背俞穴”看成一個(gè)整體，在艾灸回旋于人體周身的情況下，有重點(diǎn)地雀啄脾俞、腎俞、心俞加強(qiáng)保健培補(bǔ)作用。腎為先天之本，脾為后天之本，心為君主之官。本灸法注重了先天與后天的相輔關(guān)系，突出了心調(diào)解氣血運(yùn)行的主要功能，將人體看成整體，將治療變成保健，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看其作用穩(wěn)定，可有效地防止骨膠原及骨鈣丟失，維持骨的生物力學(xué)特性，與雌激素干預(yù)作用相似，但兩者沒(méi)有出現(xiàn)作用疊加現(xiàn)象，也是值得今后研究的問(wèn)題。

綜上所述，雀啄回旋灸十二背俞穴對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)展起到了保健預(yù)防作用，有效減慢骨質(zhì)疏松的發(fā)生，但值得注意的是艾灸和雌激素只是延緩了骨質(zhì)疏松的發(fā)展速度，與假手術(shù)組相比個(gè)別指標(biāo)也存在差異，說(shuō)明骨代謝疾病存在不可逆性，其預(yù)防比治療意義更加重大。

4 參考文獻(xiàn)

1張紅石,高 穎,楊曉慧.補(bǔ)虛化瘀針?lè)▽?duì)骨質(zhì)疏松大鼠形態(tài)計(jì)量學(xué)影響的研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志,2009;17(1):26-7.

2Du GS,Han CP.Therapeutic efficacy observation on acupuncture for postmenopausal osteoporosis〔J〕.J Acupunct Tuina Sci,2013;11(3):151-4.

3楊 廉,劉媛媛,路 暾,等.溫針灸“腎俞”穴對(duì)老年雌性大鼠性激素的影響〔J〕.中國(guó)針灸,2011;21(3):172-3.

4李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)〔M〕.第2版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007：133.

5Kim JH,Meyers MS,Khuder SS,etal.Tissue-selective estrogen complexes with bazedoxifene prevent metabolic dysfunction in female mice〔J〕. Mol Metab,2014;3(2):177-90.

6崔 偉，劉成林.基礎(chǔ)生物力學(xué)(一)〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1977;4(1)：8-9.

7Vahdati A,Walscharts S,Jonkers I,etal.Role of subject-specific musculoskeletal loading on the prediction of bone density distribution in the proximal femur〔J〕. J Mech Behav Biomed Materi,2014;30(2):244-52.

8Iki M,Morita A,Ikeda Y,etal. Biochemical markers of bone turnover predict bone loss in perimenopausal women but not in postmenopausal women-the Japanese Population-based Osteoporosis ( JPOS) Cohort Study〔J〕. Osteoporosis,2006;17(7):1086-95.

9Engelen MP,Com G,Deutz NE. Increased whole body hydroxyproline production as assessed by a new stable isotope technique is associated with hip and spine bone mineral loss in cystic fibrosis〔J〕. Clin Nutr,2013;11(2):121-7.

10Thayer SW,Stolshek BS,Gomez-Rey G,etal.Seare.Impact of Osteoporosis on high-cost chronic diseases〔J〕. Value Health,2014;17(1):43-50.

11張紅石,高 穎,王富春.補(bǔ)虛化瘀針?lè)▽?duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨力學(xué)影響的研究〔J〕.吉林中醫(yī)藥,2009;29(4)：348-9.

12張紅石,高 穎,楊曉慧.補(bǔ)虛化瘀針?lè)▽?duì)骨質(zhì)疏松大鼠形態(tài)計(jì)量學(xué)影響的研究〔J〕.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志,2009;17(1):26-7.

13王曉紅,張紅石,袁洪平.補(bǔ)虛化瘀針?lè)▽?duì)骨質(zhì)疏松大鼠Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009;27(5):1034-6.

14Xingwei II,Lingling W,Yueguang L.Effect of Acupuncture on serum interlukin-6 in women with postmenopausal osteoporosis〔J〕.World J Acup-Max,2002;12(1):24-5.