酒精性肝硬化患者維生素D受體基因多態(tài)性與肝細胞癌的相關(guān)性

張中琴

(鶴壁傳染病醫(yī)院,河南 鶴壁 458000)

西方國家肝細胞癌(HCC)多伴有肝硬化〔1,2〕。酒精、B型肝炎(HBV)和C型肝炎(HCV)是肝硬化和HCC的主要病因。HBV和HCV可直接導(dǎo)致肝致癌作用，對感染性肝癌的發(fā)生有重要影響〔1，2〕，這一現(xiàn)象亦可之于酒精性肝炎〔3〕。維生素D受體(VDR)的轉(zhuǎn)錄活性受到配體的調(diào)制，如類固醇、維甲酸類、其他一些脂溶性化合物，并受核蛋白如激活因子和抑制因子的活性影響〔4，5〕。12q13.1位點的VDR基因組長約100 kb，具有促發(fā)多種遺傳組織特異性轉(zhuǎn)錄的能力〔6〕。VDR多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、結(jié)-直腸癌、膀胱癌和腎癌的關(guān)系已經(jīng)得到證實，雖然還存在不同的見解。而且，VDR的多態(tài)性影響前列腺癌和乳腺癌的預(yù)后，對腎細胞癌和惡性黑色素瘤的預(yù)后也有影響〔7～9〕。VDR多態(tài)性在慢性肝病如原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎中也已進行了研究〔10〕。但是，VDR多態(tài)性和HCC發(fā)生之間的可能關(guān)系目前所知甚少。本研究旨在觀察VDR多態(tài)性和肝硬化HCC發(fā)生之間的關(guān)系，探討肝病病因?qū)@一關(guān)系的影響。

1 材料和方法

1.1病人選擇 共納入250例病人，肝硬化病因C型肝炎(70例)、B型肝炎80例、酒精性肝炎100例。主要人口學和臨床特征見表1。200例健康成人作為對照組，男130例；中位年齡48(18～77)歲。 病人和對照組的男性分布無統(tǒng)計學差異(65.0% vs 68.2%)。但是病人和對照組年齡存在顯著差異〔(54±8)vs(46±13)歲，P< 0.000 1〕。對照組無任何肝病臨床和(或)實驗室證據(jù)，同時排除糖尿病等疾病。

1.2組織學檢查 所有病人均進行肝活檢確定肝病變。應(yīng)用標準的染色技術(shù)檢測HCC〔11〕。

1.3維生素D檢測 采集血標本，分離并保存于-80℃待測。循環(huán)25-羥維生素D濃度應(yīng)用化學發(fā)光免疫分析技術(shù)。血清維生素D參考值采用文獻資料〔12〕，即血清維生素D濃度<10～15 ng/ml。

1.4分子生物學檢測 基因組DNA應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen,Milan,Italy)根據(jù)操作說明書由全血分離。VDR基因型分為4個二對位多態(tài)基因組： FokI C>T(rs10735810)和TaqI T>C(rs10735810)，BsmI A>G(rs1544410)和 ApaIG>T(rs7975232) 。為了檢測VDR 多態(tài)性，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR) 進行限制性片段長度多態(tài)性分析。按文獻〔8〕。方法設(shè)計引物：上游： 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA -3'，下游： 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC -3'。引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。加相應(yīng)體積的無菌超純水至總體積50 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)條件為94℃變性、66℃退火、 72℃延伸各1 min，40個循環(huán)后再延伸10 min。預(yù)先制備1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)。取PCR產(chǎn)物5 μl加6×Loading Buffer 1 μl，小心加樣于膠孔中，于一側(cè)膠孔中加入DNA marker 6 μl，以100 V電壓電泳30 min，用紫外線凝膠圖像分析系統(tǒng)分析并保存。取PCR 產(chǎn)物0.1 μg進行ApaⅠ酶切，酶切總體積為15 μl，加無菌超純水至15 μl置入電熱恒溫水浴箱中，反應(yīng)溫度為37℃，消化3 h。酶切終止后應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳，100 V電壓電泳30 min，然后用紫外線凝膠圖像分析系統(tǒng)分析基因型。

1.5統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計學分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進行t和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肝臟組織學檢查 檢出HCC 80例，33例HCV陽性，16例HBV陽性，31例為酒精性肝病(見表1)。

2.2VDR 多態(tài)性 FokI C>T(F/f)、 BsmI A>G(B/b)、ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) 等位基因和基因型頻率見表2。 病人和對照組的基因多態(tài)性遵循Hardy-Weinberg基因平衡原則。病人和對照組之間的等位基因或基因型頻率無顯著差異。BsmI和 TaqI (R2=0.92)之間存在顯著的連鎖不平衡，ApaI和TaqI(R2=0.46)、BsmI和ApaI(R2=0.48)之間也存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

2.3VDR多態(tài)性與肝臟疾病病因關(guān)系 根據(jù)群體樣本配對比較顯示病毒性肝硬化和酒精性肝硬化之間存在顯著差異(P<0.01)。 單核苷酸基因多態(tài)性的差異檢測顯示： FokI C>T(F/f)(P=0.720)； BsmI A>G(B/b)(P= 0.047)；ApaI T>G(A/a)(P= 0.052)； TaqI T>C(T/t)(P=0.065)。

2.4VDR 多態(tài)性與HCC HCC病人攜帶b/b基因型和T/T基因型較其他基因型多見。 就BsmI A>G(B/b)、ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) 來說，A-T-C單基因攜帶最多見于無HCC患者，而G-T-T最多見于HCC患者。根據(jù)不同基因攜帶分為攜帶BAT A-T-C基因組(n=128)、攜帶BAT A-T-C和G-T-T基因或均不攜帶這兩種基因組(n=73)、攜帶G-T-T單基因組(n=38)，檢出HCC的頻率分別為27.0%、38.7%和43.6%。逐步Logistic回歸分析確定攜帶BAT A-T-C和G-T-T單基因型、年齡(≤50歲、>50歲)、體質(zhì)指數(shù)(<25 kg/m2、≥25 kg/m2)、Child-Pugh 評分(≤8、>8)對預(yù)測HCC的發(fā)生的價值，結(jié)果顯示攜帶A-T-C和G-T-T單基因型可預(yù)測HCC發(fā)生，且獨立于年齡、性別、病毒因素、體質(zhì)指數(shù)。

表1 肝病患者的人口學和臨床特征±s)

表2 肝硬化和對照組的等位基因和基因型

2.5VDR多態(tài)性和肝硬化和HCC病因?qū)W關(guān)系 根據(jù)病因?qū)W對肝硬化分級組，病毒因素、酒精因素、HCC、非HCC，這4個群體間存在顯著差異(P<0.002)；酒精肝硬化伴HCC和病毒肝硬化伴HCC(P<0.000 1)、病毒性肝硬化無HCC(P<0.000 1)、酒精肝硬化無HCC(P<0.01)之間存在顯著差異。

2.6維生素D濃度與VDR單基因和HCC發(fā)生的相關(guān)性 根據(jù)性別和維生素D血清濃度(分點水平15 ng/ml)與HCC的發(fā)生存在線性趨勢關(guān)聯(lián)。分別比較女性≤15 ng/ml和>15 ng/ml、男性≤15 ng/ml和>15 ng/ml發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)逐漸增加趨勢 (0/12,0.0%；2/12,16.7%；16/38,42.1%；26/51,51.0%,P<0.000 5)。維生素D濃度>15 ng/ml與BAT ATC攜帶對HCC發(fā)生有協(xié)同作用(19.5% vs 44.8%，P<0.02)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，肝硬化病人FokI C>T(F/f)、 BsmI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a)和 TaqI T>C(T/t) 多態(tài)性的等位基因和基因型的頻率與對照組相近， 特異的多態(tài)性和自身免疫肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化的關(guān)系已經(jīng)得到觀察，雖然存在一些爭議。 實際上，BsmI A>G(B/b)多態(tài)性的B等位基因與原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)生具有關(guān)聯(lián)〔10〕，還有研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁肝硬化與b等位基因相關(guān)。慢性自身免疫肝炎和F等位基因之間存在關(guān)聯(lián)〔10〕，但也有不同的結(jié)果〔13〕。本研究中的病人為病毒性(HBV或BCV)和酒精性肝病未發(fā)現(xiàn)VDR多態(tài)性的等位基因和基因型頻率與對照組間存在任何差異。這與在HBV病人和對照組的觀察結(jié)果一致〔11〕。

本研究結(jié)果表明病毒原因和酒精病因性肝病之間的等位基因存在顯著的差異，即BsmI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a) 和 TaqI T>C(T/t) (BAT) 多態(tài)性的顯著差異與連鎖不平衡有強關(guān)聯(lián)；相反，F(xiàn)okI C>T(F/f)多態(tài)性在兩病人組間并無明顯不同。此外，單基因型分析呈現(xiàn)更為顯明的差異，BAT A-T-C單體型在病毒性病變中較之酒精性肝硬化中呈現(xiàn)更多的表達(0.46%對0.34%)。這些結(jié)果目前尚難作出清楚解釋，因為BsmI A>G(B/b)、 ApaI T>G(A/a)和TaqI T>C(T/t) (BAT)多態(tài)性位于VDR基因的未知功能區(qū)。有兩點值得考慮：即， 肝硬化的真正遺傳危險可能與這多態(tài)性的單體型連鎖不平衡有關(guān)；基因環(huán)境的交互作用具有致病作用。HCC與 BsmI A>G(B/b)多態(tài)性的b等位基因、TaqI T>C(T/t)多態(tài)性的T等位基因有聯(lián)系。BAT A-T-C 單體型與HCC呈相反關(guān)聯(lián)，而BATG-T-T單體型和HCC有直接聯(lián)系；這些關(guān)聯(lián)是獨立于已知的與HCC發(fā)生有強預(yù)測價值的主要的人口學和臨床變量。VDR多態(tài)性在許多上皮起源腫瘤中得到研究，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺和皮膚癌〔14〕。B BsmI A>G(B/b)等位基因攜帶、t TaqI T>C(T/t)等位基因攜帶對前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌等有保護性作用〔15〕；與本研究中結(jié)果相似。本研究結(jié)果提示HCC的發(fā)生和肝硬化病因之間以及VDR多態(tài)性的關(guān)系具有相互影響。分子學變異分析和估計單體型頻率突顯酒精性肝硬化伴HCC病人、酒精性肝硬化不伴HCC、病毒性硬化伴HCC以及那些無HCC的病人的VDR多態(tài)性存在差異。

維生素D在動物和細胞的抗癌活性研究受到廣泛關(guān)注。維生素D的抗癌活性是由于其對多數(shù)的細胞群抗增生和 分化作用。流行病學研究發(fā)現(xiàn)低維生素。濃度與癌癥高發(fā)生率之間存在關(guān)聯(lián)。維生素D濃度下降在酒精性肝病病人中得到證實。本研究結(jié)果提示維生素D不足(≤15 ng/ml) 見于半數(shù)以上的病人，經(jīng)性別校正后維生素D不足和HCC之間的關(guān)系仍然顯見。

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