中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病與非中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患者腦脊液中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α的表達(dá)對(duì)比

曲延章 王蘇亮 韓英杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液科,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(CNSL)系由于白血病細(xì)胞浸潤(rùn)至腦膜或腦實(shí)質(zhì)，使患者表現(xiàn)出相應(yīng)的神經(jīng)和(或)精神癥狀,否則診斷的白血病為非CNSL(N-CNSL)。絕大多數(shù)CNSL患者為腦膜浸潤(rùn)，因此腦脊液(CSF)檢查是最重要的診斷依據(jù)。目前對(duì)CNSL的診斷仍以CSF中找到白血病細(xì)胞為主要診斷依據(jù)(CSF細(xì)胞數(shù)≥10×106/L)，但缺乏敏感性，尤其對(duì)CSF中存在的微小殘留病變難以診斷。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生〔1〕。研究表明，SDF-1不僅參與維持正常造血細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)與惡性造血細(xì)胞增殖及在血液、骨髓、淋巴結(jié)的浸潤(rùn)密切相關(guān)〔2〕。研究表明，SDF-1在急性白血病中高表達(dá)〔3〕。SDF-1與其受體(CXCR)，與慢性炎癥、腫瘤的特異性轉(zhuǎn)移，尤其是血液腫瘤的耐藥、浸潤(rùn)等病理過(guò)程有密切聯(lián)系，已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一〔1〕。本文試圖探討CNSL與N-CNSL患者CSF中SDF-1α的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1病例 我院血液科住院的首次發(fā)病未經(jīng)治療的急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者79例,男40例，女39例；平均65(61～67)歲；其中CNSL 42例,N-CNSL 37例。白血病的診斷符合法國(guó)、美國(guó)、英國(guó)(FAB)協(xié)作組形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)(MIC)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4，5〕及流式細(xì)胞學(xué)免疫分型。CNSL診斷是采集患者CSF，以有無(wú)白血病細(xì)胞為根據(jù)。排除既往有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史者。對(duì)照組取自本院外科外傷手術(shù)腰麻病人，非腦脊髓疾病患者42例，男20例，女22例；平均66(60～74)歲。

1.2主要儀器及試劑 (1)酶標(biāo)儀(Bio-RAD Model 550，Bi01-Tiok公司)；(2)電熱恒溫培養(yǎng)箱；(3)人SDF-1α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Catalog Number DSA00 R&D公司)； (4)振蕩儀；(5)普通離心機(jī)。

1.3治療方法 所有病例均采用全反式維甲酸加亞砷酸雙誘導(dǎo)，分子學(xué)完全緩解后應(yīng)用化療、全反式維甲酸、亞砷酸交替維持治療。N-CNSL組在骨髓完全緩解后預(yù)防性鞘內(nèi)注藥〔甲氨蝶呤(MTX)10 mg，阿糖胞苷(Ara-c)30 mg，地塞米松(DEX)5 mg〕3次(1次/4～6 w)；CNSL組在確診后鞘內(nèi)注藥2～3次/w，直至CSF正常，以后1次/4～6 w，劑量方法同CNSL的預(yù)防。對(duì)照組按照外傷的治療原則進(jìn)行。3組治療前、治療后1個(gè)月采集CSF，以觀察SDF-1水平變化。

1.4CSF標(biāo)本的收集和處理 采集的CSF于普通離心機(jī)1 000 r/min離心15 min，取上清后低溫高速離心機(jī)于4℃下10 000 r/min離心10 min，留取上清于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5CSF SDF-1α濃度的ELISA檢測(cè) 復(fù)溫：將所有試劑及標(biāo)本溫度恢復(fù)至室溫；配制清洗緩沖液：用重蒸水1∶20稀釋；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔6孔，每孔中各加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，濃度依次序?yàn)?，50，100，250，500，1 000 pg/ml；加樣：待測(cè)品孔中每孔各加入待測(cè)樣品50 μl；在待測(cè)品孔中每孔各加入10 μl的生物素標(biāo)記液(15 s混勻)；將反應(yīng)板置(36±2)℃孵育反應(yīng)45 min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干；每孔加酶標(biāo)記溶液50 μl(15 s混勻)；將反應(yīng)板置(36±2)℃孵育反應(yīng)45 min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干；每孔加底物工作液A、B各50 μl(5 s混勻)；將反應(yīng)板置(36±2)℃孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50 μl終止液混勻，終止反應(yīng)；在450 nm處測(cè)吸光值及計(jì)算SDF-1α濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.13軟件進(jìn)行多組間方差分析和兩組間SNK(Newman-Keuls)分析。

2 結(jié) 果

2.13組入院時(shí)基線資料的比較 3組肌酐、血紅蛋白、血小板及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其他指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 3組病人入院時(shí)基線資料的比較±s)

2.23組治療前后SDF-1α的表達(dá)水平比較 3組治療前CSF中SDF-1α的表達(dá)水平存在明顯差異(F=26.923，P<0.05)，CNSL組〔(735.2±87.3)pg/ml〕明顯高于N-CNSL組〔(536.9±63.5)pg/ml〕(P<0.05)及對(duì)照組〔(459.3±54.8)pg/ml〕(P<0.05)，N-CNSL組高于對(duì)照組(P<0.05)。治療后CNSL組CSF中SDF-1α的表達(dá)水平〔(543.8±63.5)pg/ml〕明顯低于治療前(t=8.645,P<0.05)，而N-CNSL及對(duì)照組治療后CSF中SDF-1α的表達(dá)水平〔(529.7±61.4)、(462.7±57.9)pg/ml〕與治療前組均無(wú)顯著性差異(t=1.586、1.576,均P>0.05)。CNSL組治療前后差值均值與N-CNSL、對(duì)照組有顯著差異(t=10.36，t=6.86，均P<0.05)。

3 討 論

由造血干細(xì)胞惡變而形成的一個(gè)原始細(xì)胞克隆取代了正常骨髓是急性白血病常見(jiàn)的特點(diǎn)，白血病患者死亡的重要原因是惡變的造血干細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。SDF-1是骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞產(chǎn)生的趨化蛋白，SDF-1為一個(gè)低分子量的細(xì)胞因子，SDF-1/CXCR4生物軸是指由SDF與其特異性受體CXCR4相互作用而構(gòu)成的一個(gè)與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移有密切關(guān)系的耦聯(lián)分子對(duì)。研究表明SDF-1有非常重要的生物學(xué)功能〔6〕：在造血干細(xì)胞移植中，它是造血干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的關(guān)鍵因子，同時(shí)作為趨化因子也影響組織血管發(fā)生、膠原蛋白產(chǎn)生、B淋巴細(xì)胞和骨髓組織生成。

目前的臨床研究，已觀察了SDF-1在白血病患兒血清、血漿的高度表達(dá)〔3〕，也觀察了SDF-1在白血病成人血清、CSF的高度表達(dá)〔7〕,這些均提示該指標(biāo)的高表達(dá)對(duì)于該病的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后評(píng)估及髓外浸潤(rùn)有著一定的意義。本研究結(jié)果提示未治療CNSL組入院時(shí)CSF中SDF-1α表達(dá)水平提高顯著，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)生的重要特征。CNSL患者CSF SDF-1α表達(dá)異常，并且在CNSL治療后持續(xù)異常，并有可能復(fù)發(fā)，其原因可以通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以研究。

N-CNSL組入院時(shí)CSF中SDF-1α表達(dá)升高可能與存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微小殘留白血病惡性克隆有關(guān)，同時(shí)表達(dá)增多的SDF-1α對(duì)白血病細(xì)胞又可能起到維持生存、促進(jìn)增殖作用，參與形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)微小殘留病的形成與增殖，從而形成惡性循環(huán)。本研究沒(méi)有采用隨機(jī)化臨床試驗(yàn)是缺陷。

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