Heregulin和VEGF在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

周 青 王冬芽 劉 星

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 吉安 343009)

結(jié)腸癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤〔1〕，而惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因的分子水平變化的多階段過程〔2〕。文獻(xiàn)認(rèn)為〔3〕血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 是病理性血管生成最主要的刺激因子，其在多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。研究還表明〔4～6〕，許多腫瘤中VEGF受上游因子調(diào)節(jié)而過表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)。Neurcgulins(簡(jiǎn)稱NRG)是一個(gè)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)相關(guān)的生長(zhǎng)和分化因子家族〔7〕。近來研究顯示〔8～12〕，Heregulin在多種癌癥中與EGF受體家族成員HERs結(jié)合，再激活一系列的下游信號(hào)分子促進(jìn)癌細(xì)胞增殖浸潤(rùn)。但是，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中Heregulin與VEGF的關(guān)系及其意義目前仍少見報(bào)道。本研究中，筆者采用Western印跡檢測(cè)Heregulin、VEGF在結(jié)腸癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌正常組織的蛋白表達(dá)， 采用RT-PCR檢測(cè)VEGF在結(jié)腸癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)癌正常組織的基因表達(dá)，并探討二者在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取在井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院就診的結(jié)腸癌根治術(shù)患者術(shù)后的新鮮腸癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象，分組如下：(1)結(jié)腸癌組：10例，男5例，女5例，年齡33～81歲，中位年齡61歲。同時(shí)收集患者的臨床資料，包括腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)分型、分化程度、Dukes分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。(2)癌旁組織組：10例，取上述結(jié)腸癌組患者毗鄰腫瘤旁的腸黏膜組織。(3)遠(yuǎn)癌正常組織組：10例，取上述結(jié)腸癌組患者腫瘤旁10 cm以外的腸組織。癌旁組織組及遠(yuǎn)癌正常組織組均經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色病理證實(shí)無腫瘤浸潤(rùn)。

1.2Western印跡 取樣品與5倍上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進(jìn)行SDS- PAGE電泳；電泳后以穩(wěn)定18 V電壓， 半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜， 用含5%脫脂奶粉TBS/T 緩沖液封閉1 h，加入一抗， 4℃過夜， 洗膜， 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h， 暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜5 min， X 光膠片曝光，顯影，定影，PVDF膜上特異性條帶經(jīng)Olympus BX41凝膠成像儀掃描進(jìn)行相對(duì)定量。所用試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司及武漢博士德公司。

1.3RT-PCR 按EZ Spin Column RNA Purification Kit說明提取總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度(A)260 nm/280 nm比值均在1.9～2.0。以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后取出cDNA按1∶1稀釋，4℃保存。用于RT-PCR的引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中VEGF的引物序列為：正義：CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG，反義：TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC。β-actin的引物序列為：正義:ACCACCATGTACCCAGGCAT，反義：CCGGACTCATCGTACTCCTG。經(jīng)由40個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸，生成的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果用靶基因/β-actin比值表示。RNA純化試劑盒、SYBR green 染料、MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase、Trizol、dNTP、TaqDNA聚合酶等均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件。組間比較采用χ2分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Heregulin、VEGF蛋白在各組的表達(dá) 圖1可見，Heregulin和VEGF在結(jié)腸癌組織組的蛋白表達(dá)率高于癌旁組織組及遠(yuǎn)癌正常組織組(P<0.05)，VEGF mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，前者表達(dá)較高的標(biāo)本，后者表達(dá)也高。

1.結(jié)腸癌組；2.癌旁組織組；3.遠(yuǎn)癌正常組織組

2.2VEGF mRNA在各組的表達(dá) VEGF在結(jié)腸癌組織組的mRNA表達(dá)顯著高于癌旁組織及遠(yuǎn)癌正常組織(P<0.05)，見圖2。結(jié)腸癌組織中Heregulin與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

1.結(jié)腸癌組；2.癌旁組織組；3.遠(yuǎn)癌正常組織組

3 討 論

Heregulin分子量為45 kD，為表皮生長(zhǎng)因子家族(EGF家族)的分支〔13〕，具有EGF樣結(jié)構(gòu)，是Holmes等〔7〕于1992年在生長(zhǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的培養(yǎng)基中首先分離得到。近年來有資料報(bào)道〔8〕，Heregulin與HERs受體結(jié)合后可特異性激活下游信號(hào)分子或信號(hào)通路介導(dǎo)參與各種癌癥尤其是乳腺癌的浸潤(rùn)和侵襲。有文獻(xiàn)報(bào)道〔14,15〕，Heregulin誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7、MMP-1及MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，且MMPs降解胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)遷移的活性也顯著提高。在肝細(xì)胞癌HCC2998和MKN45-1細(xì)胞中，Heregulin-β1被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)細(xì)胞表面細(xì)胞間接觸的缺失及增強(qiáng)MUC1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成〔16〕。Heregulin在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其作用正引起學(xué)界的密切關(guān)注，但目前所見研究較少，具體機(jī)制尚未明確。Yoshioka等〔17〕報(bào)道，在發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者，肝細(xì)胞衍生的Heregulin可能通過增強(qiáng)integrin αvβ5介導(dǎo)的細(xì)胞遷移以及ErbB3/ErbB2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在結(jié)腸癌的細(xì)胞遷移和肝轉(zhuǎn)移過程中，發(fā)揮重大作用。本研究提示結(jié)腸癌中Heregulin過表達(dá)與腫瘤演進(jìn)侵襲關(guān)系密切。

VEGF是腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)〔18〕。VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)水平比周圍的正常組織要高，并與腫瘤的惡性程度相關(guān)〔19〕。大量研究表明〔20,21〕，新生血管、淋巴管的形成，在結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著極其重要的作用，而VEGF通過作用于其特異的VEGFR，參與了腫瘤新生血管、淋巴管的形成過程，與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。近年還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)〔22,23〕，VEGF-C表達(dá)的下調(diào)或VEGF/VEGFR2通路的下調(diào)可減慢腫瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，并指出結(jié)腸癌中卡培他濱的抗瘤效應(yīng)正是與其下調(diào)VEGF表達(dá)抑制血管生成作用密切相關(guān)。然而，結(jié)腸癌中Heregulin是否可通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)影響血管新生促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)侵襲卻鮮見報(bào)道。Nagashima等〔24〕在對(duì)乳腺癌的體外研究中發(fā)現(xiàn)，Heregulin-beta1刺激乳腺癌上皮細(xì)胞后，可誘導(dǎo)VEGF mRNA及蛋白表達(dá)，以VEGF依賴方式刺激血管生長(zhǎng)。

綜上所述，在人類結(jié)腸癌組織中，過表達(dá)的Heregulin可能通過某信號(hào)通路促進(jìn)VEGF基因啟動(dòng)區(qū)的活性，強(qiáng)化VEGF的基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)，以VEGF依賴方式誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，具體信號(hào)通路及其機(jī)制尚待深入研究。

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