丹參酮ⅡA誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制

康鄭軍 李 偉 王 坦 朱艷琴 沈曉君

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

前列腺癌嚴(yán)重威脅男性健康。內(nèi)分泌治療通過去除或阻止雄激素對(duì)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生作用，暫時(shí)抑制前列腺癌細(xì)胞的生長，延緩疾病的惡化進(jìn)展，但晚期特別是轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆缘那傲邢侔?，則成為臨床治療的難點(diǎn)。丹參酮ⅡA是從丹參中提取出來的脂溶性有效成分之一，本實(shí)驗(yàn)通過觀察丹參酮ⅡA對(duì)PC-3人前列腺癌細(xì)胞周期及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK4表達(dá)的影響，探討其拮抗PC-3增殖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 PC-3人前列腺癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2藥品及試劑 丹參酮ⅡA對(duì)照品購自中國藥品生物制品鑒定所,20 mg/瓶,批號(hào)：200619。鼠抗人CyclinD1單克隆抗體，兔抗人CDK4單克隆抗體，羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)，羊抗兔FITC-IgG(1∶400)試劑均購自Santa cruz。胎牛血清購自杭州四季青公司；胰蛋白酶、DMEM為Gibco BRL產(chǎn)品。

1.3主要儀器 BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀；蘇凈集團(tuán)安泰公司209b型超凈工作臺(tái)；德國GMBH公司Hera CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；日本Olympsu Optical公司BH-NIC-B型倒置顯微鏡。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 在37℃、5%CO2條件下，用加入終濃度為100 mg/L的鏈霉素與青霉素、含有10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，含0.01%EDTA的0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，處于對(duì)數(shù)生長期的第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按1×108/L密度稀釋后接種于96孔培養(yǎng)板每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組和丹參酮ⅡA處理組。丹參酮ⅡA處理組分別加入終濃度0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養(yǎng)48 h后，終止培養(yǎng)。

1.5MTT法細(xì)胞增殖能力檢測 收集細(xì)胞，各組加入 MTT(5 mg/ml)液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，上酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度值。

1.6細(xì)胞周期分析 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；PBS洗滌2次；離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃避光固定過夜。800 r/min離心10 min，去上清，PBS清洗兩次；重懸細(xì)胞于500 μl含100 U/ml RNaseA 的PBS 緩沖液中，避光37℃，溫浴30 min；加2 mg/ml 碘化丙啶(PI)至終濃度50 μg/ml，混勻，避光孵育30 min。以PI熒光讀數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期中不同時(shí)相的細(xì)胞數(shù)。

1.7細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4表達(dá)的檢測 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml個(gè)，將細(xì)胞懸液置于試管中，加入兔抗人CDK4單抗(1∶100)、鼠抗人CyclinD1(1∶100)100 μl，室溫孵育30 min，PBS洗滌1次，300～500 r/min離心5 min，去上清，加入羊抗兔FITC-IgG 二抗(1∶400)、羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌1次，300～500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PBS液，500目銅網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測，同時(shí)設(shè)PBS代替一抗和二抗、僅加一抗、僅加二抗的陰性對(duì)照，每份標(biāo)本測定5 000個(gè)細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析和LSD方法。

2 結(jié) 果

2.1丹參酮ⅡA對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組(0.98±0.02)比較。0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA組OD值(490 nm)分別為(0.79±0.03)、(0.77±0.02)、(0.75±0.03)，顯著降低(P<0.05)。

2.2丹參酮ⅡA對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響 丹參酮ⅡA 3個(gè)藥物劑量組S期細(xì)胞數(shù)均明顯減少，G0/G1期細(xì)胞數(shù)均增多，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)PC-3細(xì)胞增殖周期的影響±s,%，n=6)

2.3丹參酮ⅡA對(duì)PC-3細(xì)胞CyclinD1、CDK4表達(dá)的影響 丹參酮ⅡA處理組細(xì)胞CyclinD1、CDK4表達(dá)隨丹參酮ⅡA劑量增加而明顯減少，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 丹參酮ⅡA對(duì)PC-3細(xì)胞CyclinD1、CDK4表達(dá)的影響±s,n=6)

3 討 論

細(xì)胞周期是一個(gè)按特點(diǎn)順序發(fā)生的復(fù)雜過程，涉及大量調(diào)節(jié)蛋白，其核心是Cyclin和CDK，二者在細(xì)胞周期的各個(gè)階段者細(xì)胞生命活動(dòng)的過程。CDK通過與Cyclin結(jié)合，形成周期素依賴性激酶復(fù)合物而活化，活化的CDK可使其底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化修飾，并進(jìn)而引發(fā)與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)的一系列變化〔1〕。Cyclin是通過活化CDK來調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白家族，其本身沒有酶活性。當(dāng)細(xì)胞中含量低時(shí)，Cyclin與CDK解離，CDK的活性因而受到抑制。CDK4、CyclinD1均為重要的細(xì)胞周期蛋白調(diào)控基因，CDK4是CDK復(fù)合物中的催化亞基，CyclinD1/ CDK4在G1/S期過渡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，即CyclinD1和CDK4作為細(xì)胞分裂周期起始點(diǎn)G1/S期的正性調(diào)節(jié)因子，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1期前行，使細(xì)胞分裂加速〔2〕。G1末期向S期是否順利過渡意味著細(xì)胞是否由G1期進(jìn)入S期，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生及時(shí)而有顯著變化，為下階段DNA復(fù)制做好準(zhǔn)備，因此這一轉(zhuǎn)變對(duì)于推進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程具有重要意義〔3〕。

丹參酮是丹參根乙醚提取物中的成分，為丹參主要有效作用部位，丹參酮ⅡA是其脂溶性成分的代表〔4〕。研究表明，丹參酮ⅡA除了傳統(tǒng)的心血管藥理作用外，還可以通過誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用,具有開發(fā)成低毒高效抗腫瘤藥物的廣闊前景。李健等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡，其機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯、上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。王江峰等〔6〕研究證實(shí)丹參酮ⅡA可通過干預(yù)細(xì)胞周期促進(jìn)人耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)丹參酮ⅡA可抑制PC-3細(xì)胞增殖，其主要機(jī)制與CyclinD1及CDK4的低表達(dá)所致的細(xì)胞周期抑制有關(guān)。但是，丹參酮ⅡA這種藥理學(xué)作用途徑有待研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Suryadinata R,Sadowski M,Sarcevic B.Control of cell cycle progression by phosphorylation of cyclin-dependent kinase(CDK)substrates〔J〕.Biosci Rep，2010；30(4):243-55.

2Gopinathan L，Ratnacaram CK，Kaldis P.Established and novel Cdk/cyclin complexes regulating the cell cycle and development〔J〕.Results Probl Cell Differ，2011；53(11):365-73.

3袁春意,謝 瓊.丹參酮ⅡA在腫瘤領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展〔J〕.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009；15(9):67-9.

4張 萌,錢亦華,唐安琪.丹參酮ⅡA藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2010；16(17)：2661-4.

5李 健,武 彪,李映良.丹參酮ⅡA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),2012；33(7)：754-6.

6王江峰,周卸來,袁 紅,等.丹參酮A對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549/CDDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志,2010；25(6):684-8.