凝血因子Ⅴ Leiden突變檢測(cè)對(duì)肺血栓栓塞癥的預(yù)測(cè)價(jià)值

趙永娟 趙鳳芹 譚 平 石少敏

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

肺血栓栓塞癥(PTE)是肺栓塞(PE)最常見的類型〔1〕。由于PTE的臨床癥狀極缺乏特異性，漏診率、誤診率、致死率和致殘率均較高，嚴(yán)重威脅人們的生命和健康。近年來(lái)，凝血因子Ⅴ(Factor Ⅴ，F(xiàn)Ⅴ) Leiden突變(FⅤL)被認(rèn)為是形成PTE的重要遺傳危險(xiǎn)因素之一〔2～4〕。但是，該基因突變?cè)跉W美等西方國(guó)家研究較多，在亞洲等地研究較少。而且研究發(fā)現(xiàn)，該基因突變有顯著的地域差異，在歐洲某些地區(qū)FⅤL發(fā)生率達(dá)到了15%〔5,6〕，而在亞洲、非洲人中極為罕見〔2〕。我國(guó)關(guān)于PTE與FⅤL相關(guān)性研究較少，東北地區(qū)未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討FⅤL在我國(guó)東北地區(qū)PTE診斷中的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1對(duì)象 病例組：2011年1月至2013年5月就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院的PTE患者81例，男性41例，女性40例，年齡23～88歲，平均(53.71±14.04)歲。對(duì)照組：中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心健康體檢者81例，男性45例，女性36例，年齡 20～85歲，平均(51.76±14.62)歲。病例組及對(duì)照組均為在吉林省居住5年及5年以上的常住居民。兩組性別構(gòu)成及年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

納入標(biāo)準(zhǔn)：PTE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)制定的PTE診斷和治療指南〔7〕及急性肺血栓栓塞癥診斷治療中國(guó)專家共識(shí)〔8〕。均經(jīng)螺旋CT肺動(dòng)脈造影(CTPA)和(或)核素肺灌注顯像發(fā)現(xiàn)充盈缺損結(jié)合臨床癥狀確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)骨骨折、嚴(yán)重脂肪組織挫傷或脂肪擠壓傷患者合并肺栓塞；②分娩過(guò)程中及分娩后出現(xiàn)肺栓塞；③腫瘤患者合并肺栓塞。

參與研究的對(duì)象通過(guò)倫理委員會(huì)審查，尊重其知情同意權(quán)、隱私權(quán)、保密權(quán)、自主權(quán)。

1.2方法

1.2.1提取基因組DNA 受試者每人用EDTA管取外周靜脈血2 ml，按DNA提取試劑盒說(shuō)明提取有核細(xì)胞中的基因組DNA〔9〕。提取出的基因組DNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR反應(yīng) 采用PCR技術(shù)在50 μl反應(yīng)體系中，以序列分別為：FⅤ-1: 5′-TCAGGCAGGAACAACACCAT和FⅤ-2:5′-GGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT作為引物，經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增含有FⅤ基因相關(guān)片段，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小，以確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段為目的DNA片段。

1.2.3Hind Ⅲ限制性酶切 對(duì)確認(rèn)擴(kuò)增成功的FⅤ基因的PCR產(chǎn)物，用Hind Ⅲ限制酶在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，再對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)再次進(jìn)行照相分析。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS21.0軟件，頻數(shù)分布采用χ2檢驗(yàn)分析；計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 PTE病例組和對(duì)照組的FⅤ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為241 bp的DNA片段(見圖1)。

Marker:100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 500 bp;1～10:PCR產(chǎn)物;1～7:PTE患者;8～10:對(duì)照組；下圖同

2.2Hind Ⅲ限制酶酶切結(jié)果 PTE病例組和對(duì)照組的FⅤ基因片段大小均為241 bp，均為野生型，無(wú)FⅤL。即FⅤ基因表型均為1691G/1691G，1691位點(diǎn)沒有出現(xiàn)突變。見圖2。

圖2 Factor V 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Hind Ⅲ限制酶酶切電泳圖

3 討 論

FⅤL是單一點(diǎn)突變，是指FⅤ基因10號(hào)外顯子1691位點(diǎn)的核苷酸由腺嘌呤(A)替代了鳥嘌呤(G)。突變后凝血因子Ⅴ氨基酸序列506位的氨基酸由谷氨酰胺Gln替代了精氨酸Arg，使活化的凝血因子Ⅴ(凝血因子Ⅴa)分子上的活化蛋白C(APC)裂解位點(diǎn)發(fā)生改變，APC滅活凝血因子Ⅴa在Arg506位點(diǎn)位置后的Arg306位置完成，無(wú)法發(fā)揮其滅活凝血因子Ⅴa的作用〔10〕，導(dǎo)致凝血因子Ⅴa仍然具有促凝血活性，而對(duì)APC抗凝血活性產(chǎn)生抵抗，產(chǎn)生活化蛋白C抵抗(APCR)現(xiàn)象。APCR使血液的促凝系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)失衡，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，對(duì)血栓形成有明顯的促進(jìn)作用〔4，10，11〕。Ornstein等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VL是PTE最常見的遺傳性病因。Shaheen等〔3〕通過(guò)近期的研究，證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在西方人群中，95%以上的APCR現(xiàn)象是由于FVL導(dǎo)致,說(shuō)明FVL是PTE的一個(gè)重要遺傳危險(xiǎn)因子。

除遺傳因素外，PTE高危因素還包括妊娠、肥胖、近期手術(shù)等獲得性高危因素。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，若FVL攜帶者合并有獲得性高危因素，將使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)更高。Grody等〔12〕發(fā)現(xiàn)，凝血因子Ⅴ Leiden突變存在于20%的特發(fā)性靜脈血栓形成患者中，而在靜脈血栓形成的孕婦中達(dá)60%。

FVL突變的分布具有明顯地域差異〔13〕，在歐洲某些地區(qū)FVL達(dá)到了15%〔5,6〕，而在西班牙人中不常見，在亞洲、非洲人中極少有FVL〔2〕。我國(guó)山東、上海、北京、新疆等地均有關(guān)于該基因突變的研究，均未發(fā)現(xiàn)FVL〔2,14～17〕，僅鄭紅等〔18〕在正常人群中發(fā)現(xiàn)該基因突變。

我國(guó)關(guān)于FVL與PTE相關(guān)性研究較少，東北地區(qū)未見相關(guān)報(bào)道。本研究也未發(fā)現(xiàn)FVL基因雜合子或純合子突變，與國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究結(jié)果一致，但不同于歐美等西方國(guó)家?？紤]可能與以下因素有關(guān)：①FVL存在種族和地域差異性，在西方國(guó)家，F(xiàn)VL是白種人PTE最常見的遺傳性病因，但這個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)谖覈?guó)PTE人群中尚未發(fā)現(xiàn)；②本研究選擇的PTE患者例數(shù)較少，缺乏大樣本研究，可能存在該基因突變未被發(fā)現(xiàn)；③國(guó)外的研究資料提示多種凝血因子聯(lián)合突變?cè)谘ㄐ纬珊脱òl(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，而不是單一凝血因子突變〔19〕?？赡芡瑫r(shí)存在凝血因子多種突變對(duì)血栓形成有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

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