斑蝥酸鈉維生素B6對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的抑制作用

劉學(xué)識(shí)博杰 張 輝 辛 丁 許承弼 王 托 李文靜 鞠 洋 江 昌

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041)

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。早期癥狀和體征常不明顯，確診時(shí)大部分已屬中、晚期，且由于其生長(zhǎng)部位特殊，手術(shù)很難徹底切除病灶，必須進(jìn)行綜合治療。因此，尋求喉癌治療的有效藥物具有十分重要的意義。斑蝥酸鈉系斑蝥主要抗腫瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、腎癌、胃癌、宮頸癌等的治療獲得較為滿意的結(jié)果，但用于頭頸腫瘤的治療較少。本研究應(yīng)用人喉癌細(xì)胞(Hep-2)為靶點(diǎn)，觀察不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對(duì)Hep-2增殖周期進(jìn)程及凋亡率的改變。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及試劑 Hep-2細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈(zèng)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI 1640培養(yǎng)基購于美國(guó)Sigma公司，斑蝥酸鈉維生素B6注射液10 ml/支，內(nèi)含斑蝥酸鈉0.1 mg、維生素B625 mg，貴州柏強(qiáng)制藥有限公司生產(chǎn)，胎牛血清購于長(zhǎng)春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)，分為0 μg/ml組(對(duì)照組)、1 μg/ml組、2.0 μg/ml組、4.0 μg/ml組和8.0 μg/ml組，每個(gè)濃度10復(fù)孔，置37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，棄去上清，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩5 min，促進(jìn)MTT還原產(chǎn)物完全溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 mm處測(cè)定各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算Hep-2細(xì)胞增殖抑制率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，Hep-2細(xì)胞抑制率=(1-加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%。對(duì)照組A值1.38，1 μg/ml組1.26、2 μg/ml組1.12，4 μg/ml組0.91，8 μg/ml組0.76，1、2、4、8 μg/ml組抑制率分別為15.9%，18.8%，35.1%，45.8%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行，每個(gè)濃度3瓶，培養(yǎng)結(jié)束后用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩鹽(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定4℃內(nèi)保存，上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106/ml，碘化啞啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞周期結(jié)果以Moidff 2.0軟件分析。見表1。

2 結(jié) 果

2.1MTT結(jié)果 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖均有影響，且呈劑量依賴性與對(duì)照組相比差異有顯著意義(P<0.05)。見表1。

2.2流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程均有影響。G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期相對(duì)增多，且細(xì)胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期各時(shí)相影響及凋亡率的影響±s,n=3,%)

3 討 論

斑蝥酸鈉維生素B6是一種廣譜的抗癌新藥〔2〕，是斑蝥素的衍生物，它保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小。其抗腫瘤機(jī)制：①抑制腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，降低腫瘤細(xì)胞cAMP的活性；②抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA及前體的滲入，從而使腫瘤細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而殺滅腫瘤細(xì)胞〔3〕。因?yàn)镸TT試劑可被哺乳動(dòng)物活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶吸收,將黃色的MTT試劑還原成藍(lán)色不溶解的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系。因此，該方法被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究,具有一定的客觀性。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對(duì)Hep-2細(xì)胞周期各時(shí)相均有影響。細(xì)胞周期是由G1、S、G2和M所組成的一個(gè)復(fù)雜過程〔4〕，其進(jìn)程受各種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格控制，任何一個(gè)環(huán)節(jié)失控即可發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斑蝥酸鈉維生素B6制劑可阻滯Hep-2細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，從而造成G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)〔5〕，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上得到了證實(shí)。文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，斑蝥酸鈉可使多鐘腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，G1期細(xì)胞是指細(xì)胞從有絲分裂到DNA復(fù)制階段，G1期是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，而且G1期糖元合成最為顯著，G1期也是化學(xué)藥物作用的敏感點(diǎn)〔7〕。因此，抑制細(xì)胞G1期RNA的合成，從而使腫瘤細(xì)胞增殖變緩。

綜上所述，斑蝥酸鈉有明顯的抑制Hep-2細(xì)胞增殖效應(yīng)，有良好的量效關(guān)系。隨著對(duì)斑蝥酸鈉衍生物抗腫瘤機(jī)制研究的不斷深入，其在抗癌治療中的應(yīng)用必將越來越廣泛。

4 參考文獻(xiàn)

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2劉忠虎，陳艾江，馬新剛,等.斑蝥酸鈉維生素B6注射液輔以胸腔鏡內(nèi)臟神經(jīng)切斷術(shù)治療癌性腹痛〔J〕.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2013;40(5)：398-9.

3趙珍珍，李 俊，王維剛,等.不同癌細(xì)胞系對(duì)斑蝥酸鈉的藥物敏感性檢測(cè)〔J〕.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013;24(4)：10-5.

4Martin LG,Demers GW,Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human papiloma virus type/6 E7-expressing human cells is associated with altered regulation of cyclin E 〔J〕.J Virol,1998;72(2):975-85.

5Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like (PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss,2000;5(6):491-8.

6劉展華，曹 許，林麗珠,等，斑蝥酸鈉對(duì)人肺癌LAC細(xì)胞周期的影響及分子機(jī)制的研究〔J〕.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007;24(6)：486-9.

7Brtek J,Lukas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in response to DNA damage 〔J〕.Curr opin Cell Biol,2001;13(6):738-47.