活化蛋白C對(duì)體外循環(huán)大鼠肺的保護(hù)作用

周建明，胡若愚，靖勝杰，王玉華，薛新，湯文浩

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 心胸外科，江蘇 南京 210009)

本研究通過建立大鼠CPB模型，并于CPB開始前給予APC預(yù)處理，探討APC對(duì)CPB術(shù)后大鼠ALI的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，并研究其與凝血酶的相互作用關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠48只，體重 450～550 g，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組、凝血酶組、APC組、APC+凝血酶組4組，每組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要器材

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠CPB模型的建立 CPB建立方法參照文獻(xiàn)[6]并略加改進(jìn)。主要步驟如下：0.2%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉，氣管插管機(jī)械通氣，潮氣量為8 ml·kg-1。分離左側(cè)股動(dòng)脈，近心端穿刺置入24 G靜脈留置針，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，并經(jīng)該通路留取血樣標(biāo)本。尾動(dòng)脈根部穿刺置入20 G靜脈穿刺導(dǎo)管，接動(dòng)脈灌注管，經(jīng)右頸靜脈穿刺置入16 G靜脈導(dǎo)管(導(dǎo)管側(cè)面制6～8個(gè)側(cè)孔)，將導(dǎo)管插管向遠(yuǎn)端直插入右房近下腔靜脈入口處，左股靜脈置入18 G插管接靜脈引流管，接儲(chǔ)血槽(10 ml空針)，連接微量滾動(dòng)泵及膜式氧合器，膜式氧合器遠(yuǎn)心端連接動(dòng)脈灌注管經(jīng)尾動(dòng)脈進(jìn)行動(dòng)脈灌注。循環(huán)60 min后停止CPB并觀察，待大鼠心率、血壓等生命體征平穩(wěn)后，撤除血管插管，縫合手術(shù)切口，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 各組大鼠干預(yù)方法 CPB開始時(shí)凝血酶組、APC組大鼠分別給予凝血酶0.5U·kg-1、APC 0.1 mg·kg-1；APC+凝血酶組給予凝血酶 0.5U·kg-1，5 min后給予APC 0.1 mg·kg-1；對(duì)照組給予等量生理鹽水。各組大鼠分別于CPB術(shù)前、結(jié)束即時(shí)、結(jié)束后60 min抽取動(dòng)脈血1 ml，離心后留取血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。各組大鼠分別于CPB術(shù)前、CPB術(shù)后即刻、術(shù)后60 min取全血細(xì)胞，經(jīng)溶血素裂解紅細(xì)胞后洗滌、離心、重懸后獲得白細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白細(xì)胞懸液中CD11b+/CD18+細(xì)胞含量。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺毛細(xì)血管通透性指數(shù)(PMPI)測(cè)定及肺濕干重比(W/D) 處死大鼠后，解剖胸腔獲得肺組織，結(jié)扎左主支氣管，以Hank液2.5 ml經(jīng)右主支氣管灌洗，反復(fù)3次，獲得的BALF經(jīng)10 000 r·min-1離心后抽提上清，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法檢測(cè)BALF上清及血清中蛋白濃度，BALF中蛋白濃度與血清蛋白濃度之比為PMPI。

經(jīng)離心沉淀的細(xì)胞成分用Hank液在同樣條件離心沖洗2次，制成細(xì)胞懸液。在改良的Neubauer計(jì)數(shù)臺(tái)上計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)，以×109L-1表示。后進(jìn)行HE染色，在40倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，計(jì)算白細(xì)胞數(shù)量。

取部分肺組織，稱重后放入80 ℃烤箱中48 h，再稱重，計(jì)算W/D。

1.3.5 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 取左下肺葉部分肺組織(約1 cm3)，置入10%中性甲醛固定、石蠟包埋后切片，經(jīng)HE染色、封片后于光鏡下檢測(cè)肺組織損傷程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理學(xué)檢測(cè)

HE染色組織切片顯示：4組均可觀察到明顯肺組織損傷征象，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)的破壞、肺泡腔減小、肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)出血、炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡透明膜形成等。APC組肺組織病理切片較其他3組損傷程度有明顯減輕，APC+凝血酶組次之，凝血酶組肺損傷最為嚴(yán)重。見圖1。

圖1肺組織病理切片凝血酶組間質(zhì)水腫，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血，中性粒細(xì)胞聚集浸潤明顯，APC組這種改變最輕，APC+凝血酶組次之 HE×200

2.1.1 外周血CD11b/CD18流式細(xì)胞檢測(cè) 各組CPB術(shù)后其外周血中CD11b+/CD18+細(xì)胞含量明顯升高(P<0.01)，其中凝血酶組升高最為明顯。APC組在CPB結(jié)束即時(shí)及術(shù)后60 min明顯低于其他各組水平(P<0.05)。對(duì)照組與APC+凝血酶組在CPB結(jié)束時(shí)無差異(P=0.061)，術(shù)后1h APC+凝血酶組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

組 別CPB開始CPB結(jié)束即刻CPB結(jié)束60minCd11b/CD18IL-8/pg·ml-1NE/ ng·ml-1Cd11b/CD18IL-8/pg·ml-1NE/ng·ml-1Cd11b/CD18IL-8/pg·ml-1NE/ ng·ml-1對(duì)照組27.13±3.805.57±1.2324.18±4.7361.02±9.5847.69±6.2478.81±10.0963.61±7.4257.51±8.3498.78±8.71凝血酶組26.74±4.075.08±1.1427.95±5.2573.74±6.90b63.34±1.31a91.80±11.99a76.87±5.57b81.09±8.95a113.28±13.9aAPC組29.32±3.605.27±1.2029.08±4.8746.23±6.19bc29.9±4.82ac63.71±9.52bc43.01±6.97bc36.43±4.70bc79.56±8.71bcAPC+凝血酶組25.51±3.995.31±1.3426.17±3.6053.79±5.32c32.41±6.49ac69.13±11.62ac50.79±5.30bc46.72±6.50bc78.32±11.01ac

與對(duì)照組比較, aP<0.05， bP<0.01； 與凝血酶組比較, cP<0.01

組 別BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)/106L-1肺組織TNF-α/ng·g-1PMPI肺W/D對(duì)照組8.13±1.3110.27±1.601.11±0.206.77±0.84凝血酶組10.12±1.22a12.37±1.99a1.39±0.28a7.82±1.01APC組5.92±1.14ab7.44±1.91ab0.83±0.16ab5.42±0.80abAPC+凝血酶組6.64±1.19ab8.19±1.68ab0.88±0.17b5.89±0.96ab

與對(duì)照組比較， aP<0.05； 與凝血酶組比較， bP<0.01

3 討 論

據(jù)報(bào)道，ALI患者血漿蛋白C的含量明顯低于健康對(duì)照組，凝血酶調(diào)節(jié)蛋白和纖溶酶原激活物抑制物的抗原含量顯著高于健康對(duì)照組，即凝血活性增加而纖溶活性降低；這種變化與肺組織損傷的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[7]。在炎癥因子的刺激下，肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量組織因子，導(dǎo)致凝血活性明顯增強(qiáng)以及肺部微血栓的形成[8]。

ALI發(fā)生時(shí)，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加，而中性粒細(xì)胞(polymerphonuclear，PMN)等炎癥細(xì)胞凋亡延遲并在肺內(nèi)聚集[9]。凝血酶原激活后與肺泡上皮表面表達(dá)的血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，激活蛋白C生成APC，但肺泡上皮的大量凋亡阻斷了這一功能。因此，外源性APC有可能通過減少或?qū)鼓傅淖饔?，調(diào)節(jié)凝血/纖溶系統(tǒng)平衡，抑制全身炎癥反應(yīng)的發(fā)展，達(dá)到減輕肺損傷可能。