細(xì)胞穿膜肽抗人膀胱癌單克隆抗體載絲裂霉素白蛋白納米微球三聯(lián)體的靶向性和穿膜活性研究

李云龍，嚴(yán)春寅，李巧星，王偉錄，王勇，鄭紅芳，周潔

(1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 昆山 215300； 2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 蘇州 215000； 3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，廣西 南寧 530021)

細(xì)胞穿膜肽(TAT-EGFP)是一種能夠促進(jìn)多種物質(zhì)穿過細(xì)胞膜的小分子多肽，白蛋白載藥微球具有載藥量大、緩慢釋放和無毒等特性，單克隆抗體能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向結(jié)合作用。結(jié)合以上三者的長處，建立TAT-EGFP-膀胱癌單克隆抗體(BDI-1)-載藥白蛋白納米微球(MMC-Ns)三聯(lián)體TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns，可以實現(xiàn)藥物緩釋、靶向、促進(jìn)藥物內(nèi)化進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療，從而達(dá)到高效低毒的治療效果。有關(guān)三聯(lián)體對人膀胱癌細(xì)胞系EJ細(xì)胞靶向結(jié)合及穿膜活性的研究，國內(nèi)外均未見報道。作者就TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns三聯(lián)體對EJ細(xì)胞靶向結(jié)合及其穿膜活性的研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

TAT-EGFP(本課題組構(gòu)建制備)，MMC-NS(本課題組采用交聯(lián)固化法制備)，N-琥珀酰亞胺基-3-(2-毗啶基二琉)丙酸脂(SPDP, Sigma公司)，二硫蘇糖醇(DTT,德國Meek公司)，Amiga Uhm-15超濾離心管((Millipom公司)，DyLightTM549標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (H+L)抗體(EarthOx公司)，BDI-1(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院饋贈)。

1.1.2 主要儀器

高速臺式低溫離心機(jī)(美國BIO-BAD公司)，OLYMPUS熒光顯微鏡(日本)，激光共聚焦顯微鏡(LSCM，F(xiàn)V100 IX81，德國OLYMPUS公司)，JEOL掃描電鏡JSM-T300型(日本)，透視電子顯微鏡(TEM，日本JEO公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒紅色熒光蛋白感染EJ細(xì)胞

實驗前1 d，接種1×105個EJ細(xì)胞及293 T細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板中，第2天細(xì)胞貼壁后，每孔換成1 ml新鮮1640完全培養(yǎng)基，加入0.5 μl聚凝胺(polybrene)混勻，按MOI高低組加入不同量病毒，進(jìn)行病毒感染。取-70 ℃保存的病毒在冰上融化，無菌操作。在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入50 μl HBSS液稀釋好的病毒，培養(yǎng)液總體積為1 000 μl，加入病毒后輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻后置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用，在感染8～12 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基(1 600 μl·孔-1)后繼續(xù)培養(yǎng)，如果有絮狀沉淀先用D-Hanks液洗滌；如慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，4～6 h后補(bǔ)加入600 μl完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 TAT-EGFP-BDI-1-MMC-Ns三聯(lián)體的制備

應(yīng)用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP的一次偶聯(lián)法，進(jìn)行蛋白間的連接，進(jìn)行TAT-EGFP、BDI-1、MMC-Ns連接制備三聯(lián)體。

1.2.2.1 制備TAT-EGFP(M=31 kD)的SPDP衍生物TAT-EGFP-PDP (1) 先將453 μg SPDP以無水乙醇溶解，再用0.22 μm微孔濾膜過濾。將凍干無菌的融合蛋白TAT-EGFP 1.5 mg，溶于2 ml 0.01 mol·L-1PBS(pH 7.5)中，在超凈臺內(nèi)共同加入無菌小燒杯中，投料摩爾比SPDP∶TAT-EGFP=20∶1，磁力攪拌器室溫攪拌反應(yīng)30 min。(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀，10 000 r·min-1離心30 s；(3) 取上清，加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液10～12 ml，一同加至經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡消毒的超濾離心管中，3 500×g、4 ℃離心15 min；(4) 重復(fù)步驟(3)3次，以去除多余的SPDP；(5) 所得超濾離心管中的液體即為TAT-EGFP-PDP，將液體濃縮至2.0 ml。

1.2.2.2 制備蛋白微球的SPDP衍生物MMC-NS-PDP (1) 經(jīng)60Co輻照滅菌的MMC-NS 5 mg，溶于2 ml pH 7.5、0.01 mol·L-1無菌PBS緩沖液中，與經(jīng)0.22 μm微孔濾膜先濾過除菌的466 μg SPDP(無水乙醇溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配)共同加入小燒杯中，投料摩爾比SPDP∶MMC-NS=20∶1，室溫攪拌反應(yīng)30 min；(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀，10 000 r·min-1離心30 s；(3) 取沉淀，加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液1 ml混勻，12 000 r·min-1，離心2 min；(4) 重復(fù)步驟(3)3次，以去除多余的SPDP；(5)取沉淀即為MMC-NS-PDP，將其均勻分散于pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液中。

1.2.2.3 制備BDI-1的SPDP衍生物BDI-1-PDP (1) 以0.22 μm微孔濾膜先濾過227 μg SPDP，再濾過膀胱癌單克隆抗體(BDI-1)0.025 ml，用2 ml pH 7.5、0.01 mol·L-1PBS稀釋，在超凈臺內(nèi)共同加入無菌小燒杯中，投料摩爾比SPDP∶TAT=20∶1，磁力攪拌器室溫攪拌反應(yīng)30 min；(2) 攪拌后出現(xiàn)少量沉淀，10 000 r·min-1離心30 s；(3) 取上清，加pH 4.5、0.01 mol·L-1醋酸鹽(含0.15 mol·L-1NaCl)緩沖液10～12 ml，一同加入至超濾離心管中，3 500×g、4 ℃離心15 min；(4) 重復(fù)步驟(3)3次，以去除多余的SPDP；(5) 所得的超濾離心管中的液體即為BDI-1-PDP，將液體分散于無菌醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)中濃縮至1.0 ml。

1.2.2.4 BDI-1-SH的制備 在超濾濃縮至1 ml的BDI-1-PDP醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)中，加入15.4 mg DTT，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，使反應(yīng)體系中DTT終濃度為50 mmol·L-1，室溫輕輕攪拌30 min；攪拌后出現(xiàn)少量沉淀，10 000 r·min-1離心30 s；取上清，加pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液10～12 ml，一同加入至超濾離心管中，3 500×g、4 ℃離心15 min；重復(fù)步驟(3)3次，以去除多余的DTT；所得的超濾離心管中的液體即為BDI-1-SH，加入pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS緩沖液中，將液體濃縮至2.0 ml。

1.2.2.5 制備TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三聯(lián)偶聯(lián)物 將上述所得到的0.75 mg·ml-1的TAT-EGFP-PDP、2.5 mg·ml-1的MMC-NS-PDP和1 mg·ml-1的BDI-1-SH各2 ml混合，加入至同一個經(jīng)高壓滅菌的小燒杯室溫攪拌30 min，將混合液倒入用經(jīng)滅菌的小燒杯，用消毒后的錫箔紙遮蓋杯口，置于外罩一個大一號的經(jīng)滅菌燒杯置于4 ℃、磁力攪拌器低速攪拌過夜(≥16 h)；將上步(2)中過夜攪拌中的液體15 000 r·min-1離心45 s，取沉淀用pH 7.5、0.02 mol·L-1無菌PBS離心洗滌3～4次，沉淀即為目的三聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS。

1.2.3 激光共聚焦圖像顯微鏡檢測三聯(lián)體的連接情況

取對數(shù)生長期EJ細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·ml-1，置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并進(jìn)行爬片，6 h后PBS洗滌3次，加入200 μl無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃的載物臺上，調(diào)整激光共聚焦顯微鏡光電倍增管電壓值，使細(xì)胞圖像達(dá)到最清晰。

1.2.4 電子顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡檢測三聯(lián)體圖像的分析

取用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)的同一批細(xì)胞，用同一批制備的三聯(lián)體微球在同一時間分別進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡檢查。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒紅色熒光蛋白感染人膀胱癌細(xì)胞株EJ人膀胱癌細(xì)胞

見表1。

表1加入病毒的滴度、MOI及體積

病毒滴度/TU·ml-1病毒加入量/μl感染體積/ml高M(jìn)OI2.00E+09101低MOI2.00E+09201

2.2 三聯(lián)體靶向結(jié)合的監(jiān)測

2.2.1 激光共聚焦顯微鏡示三聯(lián)體與人膀胱癌EJ細(xì)胞靶向結(jié)合

見圖1。

圖1三聯(lián)體與EJ細(xì)胞靶向結(jié)合三聯(lián)體與轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白的膀胱癌EJ(t)(紅色)連接

2.2.2 掃描電鏡示單純微球和三聯(lián)體與EJ人膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合情況

見圖2。

圖2三聯(lián)體與EJ人膀胱癌細(xì)胞的結(jié)合三聯(lián)體靶向與EJ細(xì)胞結(jié)合，掃描電鏡可見腫瘤細(xì)胞表面突起和微絨毛明顯減少

2.3 三聯(lián)體穿膜活性監(jiān)測

2.3.1 激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡對三聯(lián)體穿膜活性的監(jiān)測

見圖3。

圖3三聯(lián)體穿膜活性的監(jiān)測三聯(lián)體內(nèi)化入EJ人膀胱癌細(xì)胞，透射電鏡可見載絲裂霉素納米微球進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部

2.3.2 三聯(lián)體穿膜活性的動態(tài)監(jiān)測

見圖4。

2.3.3 透射電鏡EJ人膀胱癌細(xì)胞膜微絨毛監(jiān)測

見圖5。

圖4三聯(lián)體穿膜活性的動態(tài)監(jiān)測內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的微球輪廓清晰可見，同時可見細(xì)胞表面微絨毛全部消失

圖5EJ人膀胱癌細(xì)胞膜微絨毛監(jiān)測EJ人膀胱癌細(xì)胞內(nèi)穿入多個載白蛋白納米微球，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞凋亡，穿入微球側(cè)向外凸起，同時見細(xì)胞表面突起減少、微絨毛消失

3 討 論

本研究是在課題組前期成功構(gòu)建融合蛋白穿膜肽-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)純化及鑒定融合蛋白TAT-EGFP活性基礎(chǔ)上的進(jìn)一步探索。TAT-EGFP能夠促進(jìn)多種物質(zhì)通過細(xì)胞膜，攜帶小分子蛋白、藥物分子、抗體和微粒等多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[1-2]。納米藥物應(yīng)用的關(guān)鍵之一是納米載體的設(shè)計與研發(fā)[3]，白蛋白微球是目前較成熟的一類微球，具有載藥量大、緩慢釋放藥物等特性[4-5]。單克隆抗體能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向結(jié)合與殺傷作用[6]。膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[7]，70%～80%為淺表性膀胱癌[8]。北京大學(xué)謝蜀生教授課題組針對膀胱癌細(xì)胞建株的雜交瘤細(xì)胞株能夠穩(wěn)定分泌單抗BDI-1，可特異性結(jié)合EJ人膀胱癌細(xì)胞，已經(jīng)證實該抗體作用于腫瘤細(xì)胞膜上的兩個分別為53 kb和54 kb長度的膜表面蛋白，并證實其對包括炎癥細(xì)胞和正常移形上皮在內(nèi)的其他細(xì)胞沒有交叉結(jié)合[9]。

目前已有一系列異型雙功能交聯(lián)試劑用于蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，可以實現(xiàn)控制交聯(lián)，提高交聯(lián)反應(yīng)的選擇性和交聯(lián)產(chǎn)物的均一性[10]。SPDP已經(jīng)成功應(yīng)用于多種腫瘤特異性的免疫毒素、免疫微球等抗體導(dǎo)向藥物系統(tǒng)的制備[11-13]。其交聯(lián)原理：SPDP與蛋白質(zhì)中的伯氨基反應(yīng)，分別引入吡啶二硫基，將其中1種含吡啶二硫基的蛋白質(zhì)用DTT還原成巰基，然后在含吡啶二硫基的蛋白質(zhì)與含巰基的蛋白質(zhì)之間，通過巰基與二硫鍵的交換，進(jìn)行蛋白質(zhì)間偶聯(lián)。本實驗中使用SPDP連接蛋白，具體操作步驟：第1步，將TAT-EGFP、MMC-NS、BDI-1各自與SPDP反應(yīng)引進(jìn)吡啶二硫基(PDP基團(tuán))，SPDP衍生物分別為TAT-EGFP-PDP、BDI-1-PDP、MMC-NS-PDP；第2步，用DTT將BDI-1-PDP還原成BDI-1-SH；第3步，將TAT-EGFP-PDP、MMC-NS-PDP和BDI-1-SH反應(yīng)得到本實驗的目的產(chǎn)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS。實驗過程中需要注意的是：SPDP很容易因吸水而失活，所以根據(jù)用量分裝后干燥密封存放；反應(yīng)中SPDP、DTT都是過量的，以保證完全反應(yīng)，并用相應(yīng)的方法除去雜質(zhì)。

為了進(jìn)一步標(biāo)記鑒別TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三聯(lián)體的靶向結(jié)合，我們用慢病毒對人膀胱癌EJ細(xì)胞轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白基因，用表達(dá)的紅色熒光蛋白標(biāo)記EJ細(xì)胞，用其攜帶紅色熒光在激光共聚焦顯微鏡下顯示紅色，BDI-1抗體結(jié)合抗鼠的二抗顯示黃色，微球結(jié)合帶有綠色熒光的TAT-EGFP顯示綠色，可進(jìn)一步證明了三聯(lián)偶聯(lián)物中抗體的存在。

本實驗成功制備了三聯(lián)偶聯(lián)物TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS，并進(jìn)行了初步鑒定，為下一步進(jìn)行體內(nèi)、體外的實驗奠定了基礎(chǔ)，也為膀胱腫瘤的治療以及更多其它腫瘤的治療提供了新的思路，開辟了新的方向。同時，本實驗首次在電鏡下觀測到腫瘤細(xì)胞膜表面微絨毛在三聯(lián)體內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞后消失的現(xiàn)象，其機(jī)制有待后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。

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