基于甲基乙烯基醚/馬來酸酐共聚物水凝膠三維培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞的研究

陳峻崧，陳登宇，竇駿，張?zhí)熘瑮畲淦迹谭椒剑檶?/p>

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

人體內(nèi)組織為三維(three-dimensional，3D)結(jié)構(gòu)，但是在研究人體組織結(jié)構(gòu)功能時卻往往依賴體外的二維(two-dimensional，2D)培養(yǎng)和動物模型。過去常利用普通2D細(xì)胞培養(yǎng)來研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制，但此法與體內(nèi)真實環(huán)境有很大不同，如細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用、細(xì)胞分化等[1]。而動物模型由于與人體存在種屬差異，不能很好地重復(fù)人體腫瘤生長轉(zhuǎn)移、藥物治療反應(yīng)、免疫反應(yīng)等特性，因此需要一種新的細(xì)胞培養(yǎng)方式能夠充分地模擬人體內(nèi)環(huán)境。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)則能適應(yīng)這種需求，并具有普通2D細(xì)胞培養(yǎng)簡單易行的優(yōu)勢。3D培養(yǎng)用途已在抗腫瘤藥物篩選領(lǐng)域得到了認(rèn)可，將來有望成為腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移機制研究、抗腫瘤藥物篩選和腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。

本研究課題組應(yīng)用聚甲基乙烯基醚/馬來酸酐(PMVE-co-MAH)水解產(chǎn)物甲基乙烯基醚/馬來酸共聚物(PMVE-co-MA)和交聯(lián)劑聚乙二醇進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，制得可適合用作多種腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)基質(zhì)的水凝膠TZ028和TZ029培養(yǎng)基[3]。通過對比市售商品化胞外基質(zhì)(BME)膠和膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)3D培養(yǎng)基，研究人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞在生長曲線、細(xì)胞遷移和侵襲、抗腫瘤藥物耐藥實驗等方面的差異度，確定自制的水凝膠是否像BME和膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基一樣，可模擬體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境，為分析卵巢癌SKOV-3細(xì)胞生物學(xué)特性和藥物篩選等研究提供細(xì)胞3D培養(yǎng)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

BME培養(yǎng)基(3D culture BME cell proliferatio,美國Trevigen公司，批號3445-096-K)，膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基(3-D culture MatrixTMrat collagen Ⅰ，美國Trevigen公司，批號3447-020-01)，millicell聚酞酸酯嵌入式培養(yǎng)皿(millicell polycarbonate,美國Millipore公司)，人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，DMEM完全培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS Gibco公司)和1%青鏈霉素溶液的DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液。

1.2 方法

1.2.1 交聯(lián)多聚水凝膠為PMVE-co-MAH與交聯(lián)劑聚乙二醇PEG20000進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng) 通過調(diào)整PMVE-W-MA中羧基和交聯(lián)劑中羥基的比例，獲得不同交聯(lián)密度的凝膠，交聯(lián)后凝膠中多余的羧基再用聚乙二醇單甲醚進(jìn)行酯化，最后將獲得的凝膠配成0.1wt%～10wt%之間的水凝膠分散體系。TZ028和TZ029材料為PMVE-co-MAH與交聯(lián)劑聚乙二醇PEG20000分別按照羧基的量n-COOH∶羥基的量n-OH=128∶1和256∶1進(jìn)行交聯(lián)所獲得的水凝膠[3]。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)生長曲線 分別取TZ028和TZ029材料在冰上，用無菌滴管吸取50 μl(每孔)加入96孔板中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的 CO2培養(yǎng)箱中60 min孵育形成凝膠狀；用DMEM的完全培養(yǎng)基懸浮SKOV-3細(xì)胞計數(shù)到1×105個·ml-1；按組別分別加入TZ028和TZ029材料使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%；快速取上述混合液100 μl(每孔)分別滴加入含有TZ028和TZ029材料的96孔板中，使得每孔細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×104個；放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。抽取樣品分別于第1、5、10、15、20 天加入20 μl(每孔)MTT溶液(5 mg·ml-1，即0.5% MTT)，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入50 μl(每孔)SDS三聯(lián)溶解液。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的OD值，同時設(shè)置對照孔。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲實驗 分別用35 μl(每孔)BME培養(yǎng)基和膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基與TZ028和TZ029材料包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。Transwell小室上室加入100 μl的已經(jīng)過3 d無血清培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞懸液，每孔含有1×104個細(xì)胞；下室加入DMEM的完全培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用棉簽拭去上室的細(xì)胞和凝膠，并用PBS沖洗2遍；于4%甲醛中固定，用0.4%的臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下對穿透細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。每孔隨機取5位點細(xì)胞計數(shù)，取平均值計數(shù)。

1.2.4 紫杉醇耐藥實驗 SKOV-3細(xì)胞分別加入含有BME培養(yǎng)基、 膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基、TZ028和TZ029材料的96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞；放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。96孔板中按照組別加入含紫杉醇的DMEM的完全培養(yǎng)基100 μl(每孔)，使其終濃度分別達(dá)到100 μmol·L-1。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入20 μl(每孔)MTT溶液反應(yīng)4 h，加入50 μl(每孔)SDS三聯(lián)溶解液。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的OD值，同時設(shè)置2D培養(yǎng)組及空白對照孔。

1.3 主要觀察指標(biāo)

(1) SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029材料中生長情況，繪制生長曲線；

(2) 對比BME培養(yǎng)基和膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基，研究SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029材料中的遷移、侵襲能力；

(3) 對比2D培養(yǎng)，SKOV-3細(xì)胞在TZ028、TZ029、BME培養(yǎng)基和膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基中3D培養(yǎng)對紫杉醇的耐藥性研究。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗全部重復(fù)3次，取平均值，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件包進(jìn)行處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，呈黏附、生長、增殖，形成細(xì)胞團塊結(jié)構(gòu)(圖1A)，兩材料間無明顯差別。于第1～10天細(xì)胞團塊不斷增大，結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞表現(xiàn)出快速生長狀態(tài)(圖1B)。第10～15天細(xì)胞增長處于平臺期，更換培養(yǎng)液已無法維持細(xì)胞團塊的進(jìn)一步增長，細(xì)胞生長處于緩慢或停滯狀態(tài)(圖1C)。其后至第20天，由于3D培養(yǎng)基及更換培養(yǎng)液不能再繼續(xù)支持細(xì)胞團塊的生長和增大，細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮、凋亡(圖1D)。SKOV-3細(xì)胞生長曲線(圖2)顯示，TZ028和TZ029培養(yǎng)基中3D培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞至第10～15天，細(xì)胞生長狀態(tài)好，處于平穩(wěn)階段，適合進(jìn)行藥物篩選和腫瘤細(xì)胞學(xué)的相關(guān)研究。

圖1SKOV-3細(xì)胞在TZ029培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)×100

A.第1天； B.第10天； C.第15天； D.第20天； 刻度單位：100 μm

Fig1ObservationofSKOV-3cellsculturedinTZ029(×100)

A.1st day; B.10th day; C.15th day; D.20th day； Scale bar:100 μm

圖2SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029培養(yǎng)基中3D培養(yǎng)的生長曲線

Fig2StandardgrowthcurvesofSKOV-3cells3DculturedinTZ028orTZ029

Transwell實驗結(jié)果表明，SKOV-3細(xì)胞在TZ028(圖3A)和TZ029(圖3B)培養(yǎng)基中表現(xiàn)出強于BME(圖3C)和類似于膠原蛋白Ⅰ(圖3D)培養(yǎng)基的細(xì)胞侵襲力(P>0.05)，說明對SKOV-3細(xì)胞遷移力的影響類似。經(jīng)過特定區(qū)域的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(圖4)顯示，TZ028和TZ029培養(yǎng)基中SKOV-3細(xì)胞侵襲力優(yōu)于BME培養(yǎng)基組(P<0.05)，但前兩者之間沒有差異(P>0.05)。表明TZ028和TZ029培養(yǎng)基與市售的3D培養(yǎng)基相比，能夠模擬體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲所需的內(nèi)環(huán)境。由于市售的BME培養(yǎng)基的濃度(15.04 mg·ml-1)大于膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基(10 mg·ml-1)，SKOV-3細(xì)胞為較大體積腫瘤細(xì)胞(直徑范圍50～70 μm)難以快速地在BME培養(yǎng)基中遷移，表現(xiàn)出Transwell實驗結(jié)果數(shù)值明顯低于其他材料組。

圖3SKOV-3細(xì)胞Transwell實驗×100

A.TZ028組； B.TZ029組； C.BME組； D.膠原蛋白Ⅰ組； 刻度單位：100 μm

Fig3OpticalmicroscopeimagesofmigratedSKOV-3cellsthroughTZ028，TZ029，CollagenⅠ，andBMEhydrogel(×100)

A.TZ028; B.TZ029; C.BME hydrogel; D.CollagenⅠ；Scale bar:100 μm

紫杉醇耐藥實驗結(jié)果(圖5)表明，SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029材料中形成3D結(jié)構(gòu)對紫杉醇的耐藥性要高于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型(P<0.05)。而在不同的3D培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞針對紫杉醇的耐藥性無明顯差別，表現(xiàn)為TZ028和TZ029材料與BME和膠原蛋白 Ⅰ 培養(yǎng)基耐藥結(jié)果上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

為了克服卵巢癌耐藥和提高療效，臨床上越來越多地使用藥物聯(lián)合治療方案[4-6]，但是怎樣才能尋找到最佳的聯(lián)用方案？在開展昂貴的臨床試驗前，模擬體內(nèi)環(huán)境的3D培養(yǎng)模型可能成為方便快速的篩選聯(lián)合用藥最佳方案[7]。3D培養(yǎng)模型中候選藥物與腫瘤基質(zhì)相互作用的研究，可能會有助于分析腫瘤細(xì)胞對藥物敏感性和耐藥性的實際情況。到目前為止，用于腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)的主要是動物性凝膠，如膠原蛋白Ⅰ[8]、明膠[9]、BME提取的BME 膠[10]、少量的合成生物材料如多孔微球或功能化葡聚糖等[11-12]。商業(yè)產(chǎn)品如Trevigen公司的膠原蛋白Ⅰ和BME 膠，BD公司的Matrigel 膠，大多都取自鼠尾腫瘤組織或其他動物組織。動物性凝膠的優(yōu)勢在于適合腫瘤細(xì)胞的3D生長，但缺點也較明顯。如其中含有大量的未鑒定成分，批次間存在差異，影響了對腫瘤細(xì)胞的客觀和精確的評價；此外，動物性凝膠價格相對昂貴，不利于推廣和大規(guī)模化應(yīng)用。合成生物材料中應(yīng)用最廣泛的是水凝膠[13-14]，因為水凝膠材料能夠比較真實地模擬天然細(xì)胞外微環(huán)境的很多特征，所以水凝膠類支架材料引起了廣泛的注意。PMVE-co-MAH及其水解產(chǎn)物PMVE-co-MA是對人體和動物無毒無害的高分子材料，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性優(yōu)點，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中有著非常廣泛的應(yīng)用，如作為藥用黏合劑和緩釋劑等。本研究自制了TZ028和TZ029材料，一種類似于3D培養(yǎng)的水凝膠，用于SKOV-3細(xì)胞若干特性的研究，并與市售BME膠和膠原蛋白Ⅰ膠培養(yǎng)基對比，試圖以此水凝膠替代商品化的3D培養(yǎng)基。

aP<0.05； bP>0.05

圖4SKOV-3細(xì)胞Transwell實驗細(xì)胞計數(shù)

Fig4ThenumberofmigratedSKOV-3cellsthroughTZ028，TZ029，collagenⅠ，andBMEhydrogelinappointedarea

aP<0.05; bP>0.05

圖5SKOV-3細(xì)胞在不同3D培養(yǎng)和2D培養(yǎng)條件下對紫杉醇耐藥實驗比較

Fig5EvaluationofthechemoresistanceeffectofTaxolonSKOV-3cellsindifferent3Dculturesystermversus2Done

應(yīng)用PMVE-co-MAH水解產(chǎn)物PMVE-co-MA和交聯(lián)劑聚乙二醇進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，制得可適合用作多種腫瘤細(xì)胞3D培養(yǎng)基質(zhì)的水凝膠。本研究結(jié)果顯示，SKOV-3細(xì)胞可以在TZ028和TZ029 3D培養(yǎng)的水凝膠中黏附、生長、增殖，形成細(xì)胞團塊結(jié)構(gòu)，第10～15天時達(dá)到平臺生長期，第15～20天后出現(xiàn)凋亡。提示第10～15天3D細(xì)胞培養(yǎng)為最佳細(xì)胞模型期，可進(jìn)行腫瘤細(xì)胞生物學(xué)、抗腫瘤藥物篩選等多項研究。SKOV-3細(xì)胞在TZ028和TZ029水凝膠培養(yǎng)中表現(xiàn)出與膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基相似的細(xì)胞侵襲力，且優(yōu)于BME培養(yǎng)基。在紫杉醇耐藥實驗中，TZ028和TZ029 3D培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞表現(xiàn)出與膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基和BME3D培養(yǎng)類似的耐藥性，明顯比2D培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞更為耐藥(P<0.05)。本研究提示，自制的TZ028和TZ029水凝膠與市售的BME培養(yǎng)基和膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基對細(xì)胞遷移和侵襲的影響作用相比，要優(yōu)于或類似于市售產(chǎn)品，體現(xiàn)較好的生物相容性和體內(nèi)環(huán)境的模擬性。在本實驗室，另外一組實驗采用人卵巢癌細(xì)胞HO8910細(xì)胞株，在TZ028和TZ029水凝膠與市售的BME培養(yǎng)基及膠原蛋白Ⅰ培養(yǎng)基的對比研究中，也取得了類似的結(jié)果[3]。TZ028和TZ029水凝膠材料與現(xiàn)有的生物來源的細(xì)胞3D培養(yǎng)材料相比具有成本更低、生產(chǎn)批次間質(zhì)量差異小的優(yōu)點以及多種細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，形成的3D培養(yǎng)環(huán)境更接近于體內(nèi)環(huán)境。對于藥物研究和新藥篩選具有更為準(zhǔn)確的預(yù)測作用，有望廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域抗腫瘤藥物的高通量篩選。

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