葶藶生脈方對(duì)充血性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因的影響

苑素云 郭秋紅 王 卓 苑留云 張一昕

(滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061000)

充血性心力衰竭(CHF)是臨床常見綜合征，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者心肌組織中存在凋亡的心肌細(xì)胞，使能夠工作的心肌細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少，從而導(dǎo)致心肌收縮力下降，這很可能是心力衰竭從代償期發(fā)展為失代償期的關(guān)鍵因素〔1〕。因此，細(xì)胞凋亡可能是CHF的重要發(fā)病機(jī)制。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察葶藶生脈方對(duì)CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、促凋亡基因Bax和凋亡蛋白酶Caspase-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠60只，清潔級(jí)，6 w齡，體重160～180 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：708056。60只大鼠飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由飲水進(jìn)食，喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、葶藶生脈方低、高劑量組、對(duì)照組，每組12只。60只大鼠在造模及治療過(guò)程中，死亡11只，故實(shí)際觀察到大鼠為49只。

1.2藥物及試劑 葶藶生脈方藥物組成：生黃芪30 g，紅參、丹參、麥門冬、葶藶子、益母草、五味子、紅花、赤芍藥各10 g，由河北醫(yī)科大學(xué)中藥制劑室水煎取汁，并分別配制為濃度1.5 g/ml和3.0 g/ml的水煎液。心寶丸(汕頭市麒麟藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z44022728，批號(hào)：20060731，20丸/盒，60 mg/丸)配制成濃度為0.024 g/ml的水溶液。鼠抗人單克隆抗體工作液、磷酸鹽緩沖液(PBS液，pH7.4)、羊抗鼠異硫氰酸熒光素-IgG (IgG)，均為美國(guó)DaKo公司生產(chǎn)。

1.3造模方法 除假手術(shù)組外，4組均參考Anversea方法〔2〕，在雙腎動(dòng)脈上方0.5 cm處分離腹主動(dòng)脈，沿腹主動(dòng)脈平行放置一直徑0.7 mm 7號(hào)一次性注射器針頭，用0號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和針頭結(jié)扎在一起，然后抽出針頭，造成腹主動(dòng)脈狹窄。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1給藥方法 造模后5組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。于造模4 w后開始給藥。①假手術(shù)組、模型組均予蒸餾水1 ml/100 g，每日1次灌胃。②葶藶生脈方低劑量組予1.5 g/ml濃度葶藶生脈方水煎液1 ml/100 g(即15 g/kg，相當(dāng)于成人劑量10倍)，每日1次灌胃。③葶藶生脈方高劑量組予3.0 g/ml濃度葶藶生脈方水煎液1 ml/100 g(即30 g/kg，相當(dāng)于成人劑量20倍)，每日1次灌胃。④對(duì)照組予濃度為0.024 g/ml的心寶丸水溶液1 ml/100 g(即0.24 g/kg ，相當(dāng)于成人劑量20倍)，1次/d ig。5組均連續(xù)ig 8 w。

1.4.2標(biāo)本制作 于連續(xù)灌胃8 w末，最后1次給藥后，禁食不禁水12 h，麻醉狀態(tài)下剖取心臟，在心尖部取少許心肌組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，濾紙吸干水分，70%乙醇溶液固定，4℃冰箱冷藏待檢。

1.4.3制備單細(xì)胞懸液 取已固定的心肌組織放于100目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎至1 mm3大小，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊以PBS液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目篩網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，500～800 r/min離心2 min，棄上清液保留沉淀，加入PBS液0.3 ml，稀釋混勻后，調(diào)整樣品的細(xì)胞數(shù)為1×106，用于檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.4.4檢測(cè)方法 取單細(xì)胞懸液加入鼠抗人單克隆抗體工作液0.1 ml，室溫孵育30 min，加入PBS液10 ml洗滌1次，棄上清液，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS液10 ml離心同上，棄上清液以除去未結(jié)合的熒光二抗，加入PBS液0.1 ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，應(yīng)用Expo32ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析)檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)。在對(duì)蛋白免疫熒光標(biāo)記物測(cè)定時(shí)，設(shè)一抗或二抗的本底對(duì)照和陰性對(duì)照。免疫熒光指數(shù)(FI)表示蛋白表達(dá)水平，計(jì)算方法為：FI=樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

表1可見，①與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)FI值明顯降低(P<0.05)，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)FI值及Bax/Bcl-2比值明顯增加(P<0.05)，表明模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯增加。②與模型組比較，葶藶生脈方高、低劑量組及對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)FI值明顯增加(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)FI值和Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)。③與對(duì)照組比較，葶藶生脈方高、低劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)FI 值均明顯降低(P<0.05)，葶藶生脈方高劑量組Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)FI值與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④與葶藶生脈方高劑量組比較，葶藶生脈方低劑量組Bax蛋白表達(dá)FI值、Bax/Bcl-2比值均明顯升高(P<0.05)。

表1 5組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因蛋白表達(dá)

3 討 論

CHF屬中醫(yī)學(xué)心悸、怔忡、咳喘、水腫、胸痹、積聚、虛勞等范疇，陽(yáng)氣虧虛，血瘀水停為主要病機(jī)，治宜益氣溫陽(yáng)，活血利水。葶藶生脈方中紅參補(bǔ)益心氣；黃芪益氣利水；丹參、紅花、赤芍藥活血祛瘀；葶藶子瀉肺利水；益母草活血利水；麥門冬、五味子益氣養(yǎng)陰，寧心安神。諸藥合用，化瘀不傷血，利水不傷陰，補(bǔ)氣而無(wú)溫燥之弊，共奏標(biāo)本兼治之功。

CHF時(shí)左心室功能不斷惡化是心肌細(xì)胞反復(fù)丟失和(或)剩余的心肌細(xì)胞收縮功能逐漸退化的結(jié)果，而凋亡可能是心肌細(xì)胞丟失的根源所在。凋亡使心肌細(xì)胞大量喪失，當(dāng)心肌細(xì)胞數(shù)量減少到一定程度，必然會(huì)導(dǎo)致CHF進(jìn)行性惡化。Bcl-2是目前最受關(guān)注的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因之一〔3〕，Bcl-2基因產(chǎn)物并不促進(jìn)細(xì)胞分裂，而是增強(qiáng)細(xì)胞的存活，通過(guò)抵抗多種形式的細(xì)胞凋亡延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，從而使細(xì)胞數(shù)目增加，促進(jìn)細(xì)胞生存。有研究表明Bcl-2過(guò)度表達(dá)可抑制多種因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡，而Bax過(guò)度表達(dá)不僅可使細(xì)胞自發(fā)凋亡，而且可促進(jìn)不同因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡〔3〕；大量研究認(rèn)為Caspase家族成員Caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶〔4〕，Caspase-3介導(dǎo)的凋亡在人體多種類型細(xì)胞中普遍存在，降解凋亡標(biāo)志性底物的活性最強(qiáng)。Caspase-3可被該家族其它成員(Caspase-9和Caspase-6)激活。Bcl-2等抗凋亡蛋白可通過(guò)與Bax等促凋亡蛋白形成異二聚體阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C (cyt-c)，或直接與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)、Caspase-9結(jié)合成三元復(fù)合物從而阻止Caspase-9途徑的激活，Caspase-3不能被活化，因而抑制細(xì)胞凋亡。

以往研究中發(fā)現(xiàn)，CHF模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較正常組明顯增加，細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)合成減慢，靜止期細(xì)胞居多，增殖期細(xì)胞減少〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示葶藶生脈方可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡，避免減少心肌細(xì)胞數(shù)量，恢復(fù)心肌細(xì)胞的功能，以達(dá)到抗CHF作用。

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