周圍神經(jīng)缺血后GDNF表達(dá)的變化及與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性

曾 靜 王本國(guó)

(中山市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 中山 528400)

周圍神經(jīng)損傷可以導(dǎo)致相應(yīng)節(jié)段的脊髓和背根結(jié)神經(jīng)元死亡，受損神經(jīng)元的重要表現(xiàn)是神經(jīng)元凋亡〔1，2〕。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一種可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞變性以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的蛋白質(zhì)。周圍神經(jīng)缺血可以導(dǎo)致缺血的神經(jīng)纖維發(fā)生變性，軸突的運(yùn)輸速度減慢甚至停止，相關(guān)的神經(jīng)元胞體發(fā)生變性〔3，4〕。但是周圍神經(jīng)缺血導(dǎo)致神經(jīng)纖維發(fā)生變性是否由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子不足還未證實(shí)。本研究觀察周圍神經(jīng)缺血后膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)表達(dá)的變化以及神經(jīng)元凋亡的情況，并分析二者關(guān)系。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型制備 取成年健康Wistar大鼠36只，雌雄不限，體重210～250 g。隨機(jī)選擇Wistar大鼠的一側(cè)作為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)為對(duì)照側(cè)。將大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，從腹部進(jìn)刀，將實(shí)驗(yàn)側(cè)的髂總動(dòng)脈后進(jìn)行雙重結(jié)扎，對(duì)照側(cè)不做任何手術(shù)。

1.2切片制作 于大鼠術(shù)后3、5、7、14、21、28 d各取6只，經(jīng)腹腔麻醉后，開(kāi)胸行升主動(dòng)脈插管，并用多聚甲醛固定。然后經(jīng)后入路取L4～L6脊髓節(jié)段以及雙側(cè)4～6腰脊神經(jīng)節(jié)，保存于固定液中，24 h后用乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，每隔5張取1張切片，切片厚度為5 μm，每組標(biāo)本收集5套切片備用。

1.3TUNEL法測(cè)細(xì)胞凋亡 參照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書方法對(duì)大鼠術(shù)后3、5、7、14、21、28 d切片金星原位末端標(biāo)記，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率(陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕黃色)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)元凋亡情況 凋亡的神經(jīng)元胞體體積會(huì)腫脹或者縮小，且凋亡細(xì)胞核呈深黃色或棕黃色，且位置偏移，部分神經(jīng)元會(huì)變小、固縮。通過(guò)TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡率在術(shù)后3 d時(shí)沒(méi)有明顯的變化，在5 d時(shí)凋亡率較對(duì)照側(cè)顯著升高，且凋亡率在術(shù)后14 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，但是在觀測(cè)的時(shí)間內(nèi)仍然高于對(duì)照側(cè)。而感覺(jué)神經(jīng)元在術(shù)后3 d就發(fā)生明顯的凋亡，在術(shù)后7 d時(shí)達(dá)到高峰，而到觀測(cè)時(shí)間的28 d時(shí)降至對(duì)照側(cè)水平，并且通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)凋亡的神經(jīng)元在腰髓前角散在分布，且在背根節(jié)處也散在分布于周邊。見(jiàn)表1。

表1 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元的凋亡率

2.2GNDF的表達(dá)情況 通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中GDNF的表達(dá)陽(yáng)性率在術(shù)后3 d明顯增高，然后逐漸降低，到14 d時(shí)與對(duì)照側(cè)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而感覺(jué)神經(jīng)元的變化趨勢(shì)則與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相同；實(shí)驗(yàn)側(cè)的部分神經(jīng)元胞體發(fā)生腫脹，并且細(xì)胞核偏位，神經(jīng)髓鞘中施萬(wàn)細(xì)胞著色較對(duì)照側(cè)增多，而神經(jīng)元周圍的膠質(zhì)細(xì)胞僅有部分著色。表達(dá)GDNF的神經(jīng)元細(xì)胞大多都是中等細(xì)胞，還有少量的大型細(xì)胞。免疫組化陽(yáng)性的染色后呈棕黃色，顆粒狀，大小不等。見(jiàn)表2。

表2 膠質(zhì)細(xì)胞GDNF的表達(dá)陽(yáng)性率

3 討 論

在發(fā)育過(guò)程中，決定神經(jīng)元凋亡的重要原因是神經(jīng)元是否與外界靶器官建立神經(jīng)調(diào)控通路〔5，6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，成年大鼠的坐骨神經(jīng)被切斷，腰髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元會(huì)發(fā)生凋亡，且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡占41%，感覺(jué)神經(jīng)元死亡占29%〔5，7，8〕。 本研究發(fā)現(xiàn)，切斷大鼠的坐骨神經(jīng)后，坐骨神經(jīng)相關(guān)血管的缺血會(huì)引起相關(guān)節(jié)段神經(jīng)元胞體發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，并且在術(shù)后的7～14 d最為明顯。在顯微鏡下可以看到神經(jīng)元胞體內(nèi)線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，甚至核膜溶解、破裂等現(xiàn)象〔9〕。由于這些細(xì)胞器發(fā)生了嚴(yán)重的病理變化，不能發(fā)揮正常水平的功能，無(wú)法為軸突再生提供充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)〔10〕。并且本研究結(jié)果說(shuō)明腰髓節(jié)段的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)損傷的時(shí)間較感覺(jué)神經(jīng)元較晚，但是其持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，呈漸進(jìn)性損傷。而感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間較早，且嚴(yán)重程度也較高，說(shuō)明坐骨神經(jīng)缺血對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元的影響較大，此結(jié)果與臨床上缺血性神經(jīng)病的癥狀相符。神經(jīng)細(xì)胞中胞體和軸突之間的聯(lián)系非常密切，是一個(gè)形態(tài)和功能的整體。神經(jīng)元維持正常的生理功能依賴于神經(jīng)纖維的軸漿運(yùn)輸。如果軸突出現(xiàn)損傷，神經(jīng)元胞體也必然受損，繼而影響神經(jīng)的修復(fù)和再生〔11，12〕。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡率較感覺(jué)神經(jīng)元的凋亡率較低，可能是因?yàn)槠渑c其他神經(jīng)元、組織的聯(lián)系廣泛，且軸突、樹(shù)突較多，相互之間的關(guān)聯(lián)較密切，而感覺(jué)神經(jīng)元維持正常的生理功能對(duì)靶器官來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子依賴性較大。臨床上周圍神經(jīng)缺血的疾病發(fā)生率較高，并且患者通常在短時(shí)間內(nèi)即出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙，使得該神經(jīng)支配的肢體感覺(jué)減退，運(yùn)動(dòng)功能障礙，大多預(yù)后與神經(jīng)缺血的程度平行。而神經(jīng)功能的恢復(fù)涉及多個(gè)方面，包括神經(jīng)元軸突、效應(yīng)器等。因此，研究在缺血損傷早期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元的變化對(duì)治療缺血性神經(jīng)病有重要的意義。

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