氫飽和鹽水對阿爾茨海默病模型大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響

李 健 劉春娜 劉新宇 李熙東 劉媛媛

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

活性氧自由基(ROS)可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，可誘發(fā)基因的突變、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，被認(rèn)為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病(老年癡呆)、糖尿病最主要的危險(xiǎn)因子。在阿爾茨海默病(AD)病人的尸檢中發(fā)現(xiàn),腦組織的脂質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重過氧化,自由基生成增加,細(xì)胞核和線粒體的DNA均損傷,其中線粒體的DNA損傷最嚴(yán)重。2007年日本學(xué)者首先報(bào)道，氫溶解在液體中可以選擇性中和氧化損傷的重要介質(zhì)羥自由基和亞硝酸陰離子〔1〕，動(dòng)物呼吸2%的氫可以顯著改善腦缺血再灌注損傷，目前已報(bào)道了氫氣對多種疾病的治療作用，主要集中在器官缺血再灌注損傷〔2,3〕、器官移植損傷〔4,5〕、炎癥及變態(tài)反應(yīng)疾病〔6,7〕、代謝綜合征〔8〕、減輕放療、化療的毒性作用〔9〕、部分神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等〔10〕，但對AD學(xué)習(xí)記憶功能的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬考察氫飽和鹽水對AD模型大鼠化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 丙二醛(MDA)，南京建成；4-羥基壬烯醛(HNE)，Alpha，USA；纖維酸性蛋白(GFAP)，Biotime，China；腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)-6、IL-1β，R&D，USA；8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OH-dG)，Groundwork，USA。

1.2主要儀器 分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、切片機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、照相系統(tǒng)、超低溫冰箱，微量冷凍離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，精密分析天平、震蕩水浴等。

1.3MDA測定 斷頭處死大鼠,冰盤上快速取腦,將右側(cè)腦組織(去除嗅球和小腦,取大腦中前段)用冰生理鹽水沖洗濾紙吸濕后,稱取皮層腦組織濕重0.3 g,加入預(yù)冷的生理鹽水,用勻漿器制成10%(皮質(zhì)重量mg/生理鹽水體積μl)的組織勻漿,4℃ 3 500 r/min,離心10 min,提取上清液,-20℃凍存待檢。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法,應(yīng)用752型分光光度計(jì)測定。

1.4免疫組化測定4-羥基壬烯醛(HNE)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-d G)的表達(dá) 將腦組織按固定、脫水、石蠟步驟處理后，進(jìn)行連續(xù)切片，片厚 5 μm，每個(gè)腦組織切片 3 張，石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟梯度酒精水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×3 min。用封閉通透液浸潤切片30 min，PBS洗3次×3 min。切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次。PBS溶液洗3次×3 min；將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清后放入濕盒中,室溫30 min。甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗(1∶250、500、1 000)后，放入濕盒中室溫1 h，然后4℃過夜，從冰箱中取出需37℃復(fù)溫45 min。將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min(回收)，用PBS洗5次×5 min。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色檢測，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。按免疫組織化學(xué)程序檢測HNE、8-OH-d G的表達(dá);表達(dá)陽性的細(xì)胞在光鏡下細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒。圖像分析采用Image pro plus圖像分析軟件，在每個(gè)視野相同部位選定相同面積組織區(qū)域，計(jì)算陽性細(xì)胞，每個(gè)切片取3個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)。觀察部位可選擇海馬、皮層及內(nèi)嗅區(qū)、基底前腦等。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD、Student-Newman-Keuls分析。

2 結(jié) 果

2.1氫飽和鹽水對腦組織MDA含量的影響 模型組大鼠腦組織MDA含量為(6.65±1.07)nmol/mgprotein，與假手術(shù)組〔(4.18±0.78)nmol/mg protein〕相比顯著升高(P=0.000)，而氫飽和鹽水治療組大鼠腦組織的MDA含量〔(5.53±0.74)nmol/mg protein〕較模型組大鼠顯著降低(P=0.016)。

2.2氫飽和鹽水對腦組織HNE表達(dá)的影響 給予氫飽和鹽水治療后14 d，海馬齒狀回細(xì)胞被染成棕黃色，呈現(xiàn)HNE陽性細(xì)胞。模型組大鼠海馬齒狀回顯現(xiàn)較多的HNE陽性細(xì)胞(11.17±3.43)，假手術(shù)組大鼠鮮見HNE陽性細(xì)胞(0.50±0.84)，而氫飽和鹽水治療組大鼠海馬齒狀回HNE陽性細(xì)胞(7.33±1.75)較模型組大鼠顯著減少(P=0.011)。見圖1。

2.3氫飽和鹽水對腦組織8-OH-d G 表達(dá)的影響 海馬齒狀回呈現(xiàn)棕黃色8-OH-d G染色陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組(4.67±1.75)相比，模型組大鼠海馬齒狀回出現(xiàn)明顯增多的8-OH-d G染色陽性細(xì)胞(19.17±4.30)(P=0.000)，而經(jīng)氫飽和鹽水治療后的模型大鼠海馬齒狀回8-OH-d G染色陽性細(xì)胞(10.50±2.71)明顯減少(P=0.000)。見圖2。氫飽和鹽水治療后10 d，頂葉皮層呈現(xiàn)棕黃色8-OH-d G染色陽性細(xì)胞。與假手術(shù)組(1.83±1.62)相比，模型組大鼠頂葉皮層出現(xiàn)明顯增多的8-OH-d G染色陽性細(xì)胞(13.33±2.43)(P=0.000)，而經(jīng)氫飽和鹽水治療后的模型大鼠頂葉皮層8-OH-d G染色陽性細(xì)胞(5.50±1.76)明顯減少(P=0.000)。見圖3。

圖1 各組大鼠腦組織HNE表達(dá)陽性細(xì)胞(DAB)

圖2 各組大鼠海馬齡狀回8-OH-d G表達(dá)(DAB)

圖3 各組大鼠頂葉皮層8-OH-d G表達(dá)(DAB)

3 討 論

目前已明確的AD致病基因蛋白APP、ApoE或PS在調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡或結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)金屬方面均與氧化應(yīng)激作用有關(guān)〔11〕。Aβ是OS與AD腦神經(jīng)元死亡之間的耦聯(lián)分子。氧自由基也可促進(jìn)淀粉樣蛋白前體(APP)裂解生成Aβ增加,二者具有相互促進(jìn)的效應(yīng)。

老年人在增齡的過程中,腦內(nèi)自由基的清除能力降低，神經(jīng)元細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化而產(chǎn)生大量自由基。這些自由基損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能嚴(yán)重破壞,從而促使AD的形成。氧自由基能促進(jìn)Aβ的毒性和聚集,使其在腦內(nèi)過度活躍,導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變而發(fā)生AD;而Aβ也使自由基生成增多。有人用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對自由基與Aβ的因果關(guān)系進(jìn)行一系列的活體內(nèi)研究,發(fā)現(xiàn)Aβ的沉積能誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生,自由基增多又極大地促進(jìn)了Aβ的沉積,造成一種神經(jīng)細(xì)胞受損和功能紊亂的惡性循環(huán)〔12〕。氧自由基損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),生成大量脂質(zhì)過氧化物,最終產(chǎn)物是MDA,MDA的量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示氫飽和鹽水治療可以明顯降低AD模型大鼠腦組織中MDA的水平，提示其清除自由基的能力較強(qiáng)，減少了氧自由基對細(xì)胞膜的損傷，從而改善細(xì)胞的變性、凋亡或者死亡。HNE是明確的OS標(biāo)志物，是在AD 造模及相關(guān)研究中常用的毒性羰基,它對人工培養(yǎng)的初級(jí)神經(jīng)元、神經(jīng)瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等許多細(xì)胞功能都有影響。Kim等〔13〕發(fā)現(xiàn)在AD 患者腦皮質(zhì)的某些區(qū)域呼吸鏈復(fù)合物的活性降低,HNE 抑制神經(jīng)突觸生成并對Neuro 2A 細(xì)胞的微管蛋白網(wǎng)絡(luò)起迅速的、實(shí)質(zhì)性的破壞作用。在培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的過程中,神經(jīng)元置于含有2 μmol PL的HNE 的培養(yǎng)基中2 h 便會(huì)導(dǎo)致Tau 蛋白的磷酸化程度增高,使Tau 蛋白對去磷酸化具有抵抗作用,這可以被AT8 抗體所識(shí)別。AD病人的腦室腦脊液及血清中HNE顯著增高也證明其可作為AD的生物標(biāo)志物〔14〕。加入Aβ1～42培養(yǎng)的神經(jīng)元HNE含量增高。 HNE 抑制血漿中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，破壞微管排列，抑制線粒體功能。

8-OHdG是羥自由基在DNA堿基的C-4、C-5或C-8位置上與脫氧鳥嘌呤核苷酸殘基結(jié)合并進(jìn)一步氧化生成的,通過檢測血清8-OHdG可以間接反映OS的程度。8-OH-dG是衡量細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA氧化損傷程度的重要標(biāo)志。一些研究〔15,16〕分別觀察到正常衰老過程中機(jī)體重要組織和AD患者大腦細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核DNA中8-OH-dG含量明顯升高。8-OH-dG的含量不僅反映DNA損傷程度,還標(biāo)志機(jī)體代謝和修復(fù)能力下降。

本實(shí)驗(yàn)觀察到氫飽和鹽水可以降低Aβ1～42誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦組織MDA水平，減弱海馬OS損傷標(biāo)志物HNE、8-OH-d G的免疫反應(yīng)，提示氫飽和鹽水對Aβ1～42誘導(dǎo)的AD模型大鼠腦組織OS損傷具有保護(hù)作用。

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