老年宮頸鱗癌術(shù)后組織中Geminin、組織蛋白酶D和增殖細(xì)胞標(biāo)志物67表達(dá)的關(guān)系

張 紅 尤正芳

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院婦科，上海 201700)

子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率呈雙峰形，即在青年人和老年人多發(fā)。老年宮頸癌常與人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染不相關(guān)，即與病毒無關(guān)，而與癌基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)失常密切相關(guān)。細(xì)胞周期相關(guān)因子Geminin是位于細(xì)胞核的小分子多功能蛋白，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，并在細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和腫瘤生長方面發(fā)揮重要作用〔1，2〕。組織蛋白酶(Cath)-D是具有肽鏈內(nèi)切酶活性的蛋白，是在缺氧時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白之一，Cath-D高表達(dá)時(shí)不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖過程，還可能對脈管形成有一定作用〔3〕。增殖細(xì)胞標(biāo)志物(Ki)67是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其在G1、S、G2和M期有表達(dá)，而在G0期無表達(dá)〔4〕。目前認(rèn)為Ki67是最理想的標(biāo)記腫瘤細(xì)胞增殖的蛋白。本文探討老年子宮頸鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后組織中Geminin、Cath-D和Ki67的表達(dá)及其相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1臨床資料 2010年1月至2012年12月我院婦產(chǎn)科行子宮頸鱗狀細(xì)胞癌根治手術(shù)的老年患者132例作為觀察組，術(shù)后立即取組織，放于-80℃冰箱中待檢。納入均依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)醫(yī)師再次核對。年齡60～84〔平均(69.0±6.2)〕歲。其中角化型鱗癌40例，非角化型鱗癌92例。手術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。同時(shí)選取老年子宮脫垂并診斷為慢性子宮頸炎的老年宮頸鱗狀上皮組織70例作為對照組，術(shù)后立即取組織，放于-80℃冰箱中待檢。年齡60～80〔平均(67.5±5.5)〕歲。兩組一般臨床資料無明顯差別，具有可比性。

1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測Geminin、Cath-D和Ki67的表達(dá) Geminin、Cath-D和Ki67蛋白的濃縮液均由武漢博士德生物工程有限公司代購。在正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，依不同比例進(jìn)行稀釋，選擇染色最理想的濃度進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的正式實(shí)驗(yàn)。取出凍存組織，置于75%酒精中固定24～48 h后，制備組織的單細(xì)胞懸液(1×106/ml)，取1 ml，分別加入Geminin、Cath-D或Ki67一抗，在室溫中孵育30 min，加入PBS 10 ml洗滌一次，棄上清，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清。加入PBS 0.1 ml，過濾后用上機(jī)檢測(美國BC公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀)，應(yīng)用 Expo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。

1.3Geminin、Cath-D和Ki67的判定方法 以熒光指數(shù)(FI)表示Geminin、Cath-D和Ki67蛋白表達(dá)的相對含量。FI=蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度/對照樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組Geminin、Cath-D和Ki67的表達(dá)比較 觀察組Geminin、Cath-D和Ki67的表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.000 1)。見表1。

表1 兩組中Geminin、Cath-D和Ki67表達(dá)水平比較

2.2觀察組不同臨床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表達(dá)比較 觀察組Geminin、Cath-D和Ki67表達(dá)與腫瘤的最大徑、是否累及宮頸管及臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.3觀察組Geminin、Cath-D和Ki67表達(dá)的關(guān)系 觀察組Geminin和Ki67(r=0.58，P=0.011 2)、Cath-D和Ki67(r=0.47，P=0.027 4)的表達(dá)均具有正相關(guān)性。

表2 觀察組不同臨床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表達(dá)的比較

3 討 論

老年患者癌變常起源于萎縮的鱗狀上皮，常常是非HPV感染相關(guān)的。由于老年患者常伴有退性改變及激素分泌減少，因此其癌變過程可能更復(fù)雜。近年研究表明老年患者宮頸鱗狀上皮的異常增殖是引起病變的重要因素，因此促進(jìn)增殖的基因和蛋白起的作用較為明顯〔4,5〕。Geminin是1998年發(fā)現(xiàn)的一種小分子蛋白，其有二種異構(gòu)體，即H型和L型，分別含有219個(gè)和216個(gè)氨基酸，有研究顯示Geminin是一種核定位蛋白，其第50～116之間的氨基酸序列為典型的雙向核定位信號(hào)，常由2個(gè)堿性氨基酸簇組成〔6,7〕。也有人認(rèn)為Geminin在細(xì)胞有絲分裂期能夠發(fā)生周期特異性降解，使細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞生長迅速〔8〕。近年研究關(guān)注Geminin在腫瘤中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤中表達(dá)升高〔9,10〕。Cath-D是定位在染色體11p15的基因，也是被普遍認(rèn)為靠近H-ras的原癌基因〔11〕，其表達(dá)產(chǎn)物的分子量為34 kD，為溶酶體內(nèi)的天冬氨酸蛋白酶。上皮細(xì)胞癌變后，Cath-D表達(dá)增高，引起自體蛋白的激活，使血漿酶原激活劑和膠原酶中的初始蛋白發(fā)生明顯水解，Cath-D可以通過自分泌和旁分泌形式激活Cath-B，加速腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的活化。Ki67是常規(guī)應(yīng)用于臨床的一種增殖細(xì)胞標(biāo)志物，其特點(diǎn)是穩(wěn)定〔12〕，存在于細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期，其蛋白表達(dá)在細(xì)胞核中，其功能與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)〔13〕。

本研究的結(jié)果提示Geminin、Cath-D和Ki67高表達(dá)可以有效促進(jìn)腫瘤的發(fā)生過程。Geminin在作用過程中可以精確地調(diào)節(jié)DNA復(fù)制，在S、G2和M期特異性聚集、阻止MCM2-7與復(fù)制特許物有效地連接〔14〕，抑制DNA的過度復(fù)制〔15〕。Cath-D作用可能具有多元性，即通過多種通路調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展，如其作為雌激素調(diào)節(jié)的溶酶體蛋白酶，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速腫瘤進(jìn)展，其次Cath-D還可以促進(jìn)腫瘤的血管生成，為腫瘤提供其生長必需的氧和營養(yǎng)〔16〕。本文結(jié)果提示Geminin、Cath-D和Ki67參與腫瘤的生長及侵犯，與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切。由于以上因素均為臨床判斷腫瘤生物學(xué)過程及預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)，因此術(shù)后常規(guī)檢測組織中Geminin、Cath-D和Ki67的表達(dá)，對判斷腫瘤生物學(xué)行為及初步判斷患者預(yù)后可能有一定價(jià)值〔17〕。Geminin、Cath-D與Ki67之間具有正向協(xié)同作用，也提示Geminin和Cath-D通過影響Ki67表達(dá)的增殖指數(shù)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長及癌性增生的作用。但是其作用機(jī)制及作用途徑有待更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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