牛蒡顆粒劑對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的影響及糖尿病心肌病變的防治

劉長山 李 萍 王秀軍 柳 林 孫麗萍 劉海霞 明 義 劉 慧 丁穎超

(濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濰坊 261041)

研究證實，葡萄糖誘導(dǎo)的活性氧簇(ROS) 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是糖尿病心肌病(DCM)的重要發(fā)病機(jī)制〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡同樣參與了DCM發(fā)生發(fā)展的整個過程，但目前關(guān)于DCM過程中氧化應(yīng)激與心肌細(xì)胞凋亡作用的研究報道甚少。本研究觀察中藥牛蒡?qū)ρ趸瘧?yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡的影響及對DCM的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1糖尿病動物模型的制備及實驗動物分組 健康雄性6周齡Wistar大鼠30只(由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重180～200 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1 w后，隨機(jī)取10只作為正常對照組，其余20只擬作為糖尿病觀察組，于左下腹腔按60 mg/kg體重注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液，注射后72 h斷尾用羅氏血糖儀測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病動物模型建立。將20只模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和牛蒡治療組,每組10只，各組間血糖值無差異。

1.2試劑 STZ購自美國Alexi公司。牛蒡購自山東天達(dá)生物制藥有限公司。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。Bcl-2、Bax免疫組化測定藥盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。H-7500透射電鏡,日本HITACHI公司。UV-260型分光光度計，日本島津公司。

1.3標(biāo)本的處理及收集 牛蒡治療組灌胃給藥150 mg·kg-1·d-1，糖尿病對照組和正常對照組則用等容量生理鹽水1 ml·100 g-1·d-1灌胃干預(yù)。于實驗的第4、8、12、16周測定血糖，16 w時處死大鼠。期間糖尿病對照組大鼠死亡1只，正常對照組及牛蒡治療組無死亡。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取部分左室心肌組織制備心肌勻漿檢測MDA含量及SOD水平。常規(guī)石蠟切片，透明、復(fù)水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，DAB顯色。另取大鼠左心室組織 8～10塊，常規(guī)甲醛溶液固定進(jìn)行HE染色，另取部分心肌組織經(jīng)戊二醛固定，以備透射電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖變化 試驗前各糖尿病大鼠血糖均顯著高于正常對照組(P<0.01)，治療16 w結(jié)束時，糖尿病組及牛蒡治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P>0.05)，兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖比較

2.2各組大鼠心肌組織MDA含量、SOD水平的變化 與正常對照組比較，糖尿病各組MDA含量均升高(P<0.01)，SOD水平均降低(P<0.01)；與糖尿病組比較，牛蒡治療組MDA含量降低(P=0.000)，SOD水平升高(P=0.000)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量變化

2.3各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 正常對照組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白明顯表達(dá),糖尿病組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少，牛蒡治療組Bcl-2蛋白表達(dá)較糖尿病組增多。正常對照組大鼠心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)較弱，糖尿病組心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)明顯增多，牛蒡治療組Bax蛋白表達(dá)較糖尿病組減少。

2.4心肌組織光鏡HE染色觀察 正常對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，無心肌纖維的破壞，細(xì)胞間隙正常，心肌間質(zhì)及微血管等結(jié)構(gòu)正常；糖尿病組出現(xiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹，肌原纖維紊亂，心肌纖維間結(jié)締組織增多；牛蒡治療組心肌細(xì)胞排列輕度紊亂，心肌纖維間結(jié)締組織增生現(xiàn)象較糖尿病組有所減輕。

2.5心肌組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察 糖尿病組表現(xiàn)為閏盤連接處部分心肌纖維出現(xiàn)肌絲減少、肌斷裂，心肌纖維內(nèi)部分線粒體空泡樣變、髓樣變，線粒體嵴模糊，嵴斷裂，細(xì)胞核不規(guī)則,核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)邊集等；牛蒡治療組顯示閏盤周圍線粒體病變不明顯，少數(shù)線粒體旁邊有小的空泡，線粒體嵴比較規(guī)整，部分線粒體嵴清晰，較糖尿病組有所減輕。

3 討 論

DCM是糖尿病常見的嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是引起糖尿病心力衰竭的主要因素，也是糖尿病晚期死亡的主要原因。它是以心肌肥大、心肌纖維化、細(xì)胞水平鈣轉(zhuǎn)運缺陷、心肌收縮蛋白膠原形成和脂肪酸代謝異常等為特征的一種獨特的心肌病變〔2〕。

研究發(fā)現(xiàn)DCM的發(fā)生發(fā)展與血糖升高程度、持續(xù)時間〔3〕密切相關(guān)。長期高血糖環(huán)境下心肌組織中ROS產(chǎn)生增加，抗氧化酶SOD活性下降，機(jī)體對氧自由基的清除能力大大減弱，機(jī)體對氧自由基的清除能力大大減弱，這種動態(tài)失衡勢必造成體內(nèi)大量ROS的有害蓄積，引起ROS的連鎖反應(yīng)，從而加重了氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激引起心肌脂質(zhì)過氧化損傷，對心肌細(xì)胞內(nèi)包括蛋白質(zhì)，脂類與核酸等生物大分子造成氧化損傷，導(dǎo)致生物膜溶解和細(xì)胞凋亡，引起心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，進(jìn)而導(dǎo)致DCM的發(fā)生〔4〕。

細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞由肥大轉(zhuǎn)向衰竭的重要病理改變，近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡在DCM的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用〔5〕。

凋亡相關(guān)基因可分為凋亡促進(jìn)基因和抑制基因兩種。這兩類基因相互作用的結(jié)果決定細(xì)胞是生存還是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止細(xì)胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡。

高血糖通過何種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖導(dǎo)致氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，當(dāng)外源性活性氧及細(xì)胞內(nèi)ROS 生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細(xì)胞凋亡。氧化損傷引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：ROS損傷細(xì)胞中的DNA，除激活P53基因外，還引起多聚ADP核糖合成酶活化，耗竭輔酶Ⅰ(NAD)，消耗大量ATP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的與凋亡相關(guān)的基因除了與Bcl-2有關(guān)外，c-Myc和Fas-FasL也參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔6〕。

本實驗提示高血糖通過增加心肌組織氧化應(yīng)激而促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞凋亡而參與DCM的發(fā)生發(fā)展。中藥牛蒡可能通過抑制心肌組織氧化應(yīng)激、干預(yù)心肌組織細(xì)胞凋亡防治DCM的發(fā)生發(fā)展。

自日本人田川越等從牛蒡中獲得牛蒡苷以來，關(guān)于牛蒡化學(xué)活性物質(zhì)的研究取得了重要進(jìn)展，從其果實、莖葉和根中分別獲得30余種不同類型的天然化合物，并發(fā)現(xiàn)了多種重要的藥理和生理活性〔7〕。本實驗所用牛蒡采用天然牛蒡為原料，依據(jù)傳統(tǒng)中藥焙炒、煎煮的炮制方法結(jié)合現(xiàn)代生物提取技術(shù)，制成顆粒制劑。研究發(fā)現(xiàn)中藥牛蒡具有抑制氧化應(yīng)激及心肌保護(hù)作用，而且中藥毒副作用極低，加上DCM病程遷延，這就決定其用藥治療的過程將是長期的甚至是終生的，藥物的副作用及費用均應(yīng)考慮。

4 參考文獻(xiàn)

1Seager MJ,Singal PK,Orchard R,etal.Cardiac cell damage：a primary myocardial disease in streptozotocin-induced chronic diabetes〔J〕.Br J Exp Pathol,1984；65(5)：613-23.

2Malhotra A,Sanghi V.Regulation of contractile proteins in diabetic heart〔J〕.Cardiovasc Res,1997；34(1):34-40.

3Sambandam N,Abrahani MA,Craig S,etal.Metabolism of VLDL is increased in streptozotocin-induced diabetic rat hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2000；278(6):H1874-82.

4Aneja A,Tang WH,Bansilal S,etal.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis,diagnostic challenges,and therapeutic options〔J〕.Am J Med,2008；121(9):748-57.

5Fang ZY,Prins JB.Diabetic cardiomyopathy:evidence,mechanisms,and therapeutic implications〔J〕.Endocr Rev,2004；25(4):543-67.

6Kamimoto Y,Sugiyama T,Kihira T.etal.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1,an antioxidative and anti-apoptotic protein,prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010；53(9):2046-55.

7劉樹民，李玉潔，李淑蓮,等.牛蒡根抗衰老作用的實驗研究〔J〕.中醫(yī)雜志，2004；45(8)：617-8.