siRNA干擾堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)對(duì)肺腺癌A549增殖和克隆特性的影響

白小燕 孟又勝 王秀問 王亞偉

(成都市第五人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 611130)

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源，它們具有無限的自我更新、增殖、多潛能分化及抗拒化放療等特點(diǎn)，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療才是根本。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在人體正常組織和多種腫瘤廣泛表達(dá)，bFGF信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及維持干細(xì)胞特性方面起重要作用。因此，本研究應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制bFGF表達(dá)，觀察bFGF信號(hào)通路對(duì)A549的增殖和自我更新等特性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑 A549細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RPMI-1640購自Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)購自TBD公司； bFGF抗體購自SANTA CRUZ公司；β-actin及OCT-4抗體系A(chǔ)bcam公司產(chǎn)品；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IG購自中杉金橋公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；ECL發(fā)光液購自北京博奧森公司； FGF2-RNA質(zhì)粒載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京TIANGEN公司；Nano Fectin轉(zhuǎn)染試劑購自SBI公司；Trizol購自Invitrogen；引物購自上海博尚生物公司。

1.2主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Heraus公司)、SWCJ型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)、ELx800酶標(biāo)儀(美國Bio-TEK公司)、倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、凝膠分析儀(江蘇捷達(dá)科技公司)、PTC-200 DNA擴(kuò)增儀(美國MJ公司)、紫外分光光度計(jì)(美國Bekman公司)、低溫高速離心機(jī)(美國Dupont公司)、臺(tái)式高速離心機(jī)及移液器(德國eppendorf公司)、恒壓恒流電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、濕度為100 %的孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。

1.3.2bFGF干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 以bFGF編碼基因(GenBank ID:NC_000004)的799～819區(qū)域?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)siRNA干擾序列： 5′-ACTACAATACTTACCGGTCAA-3′，Loop結(jié)構(gòu)為CTCGAG，命名為pGCsiU6/ puro/GFP-bFGF-siRNA,以無關(guān)序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′作為陰性對(duì)照(NC)，此序列不與任何人類基因序列同源，命名為pGCsiU6/ puro/GFP-NC-siRNA。質(zhì)粒構(gòu)建及測通等具體工作由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.3.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞分組 轉(zhuǎn)染前1 d制備A549單細(xì)胞懸液接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)50%～80%匯合時(shí)，按NanoFectinTM說明書步驟分別進(jìn)行pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA和pGCsiU6/puro/GFP-NC-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，按1∶5傳代，細(xì)胞貼壁良好后加入1 mg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選，2 w后熒光顯微鏡下挑選多個(gè)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的單一抗性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA的A549細(xì)胞(干擾質(zhì)粒組)和穩(wěn)定表達(dá)pGCsiU6/puro/ GFP-NC-siRNA的A549細(xì)胞(陰性對(duì)照組)。以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.3.4Real-time PCR檢測bFGF mRNA表達(dá) 引物序列設(shè)計(jì)：bFGF上游引物為5′-AGTGTGTG CTAACCGTTACCT-3′,下游引物為5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTG-3′；以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，上游引物為5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。收集各組細(xì)胞，按Trizol說明書提取總RNA，測純度、濃度。按照PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后按SYBR Green反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后繪制熔解曲線及擴(kuò)增曲線，以SDS2.0軟件分析Ct值，將各bFGF Ct值減去GAPDH Ct值得ΔCt值，ΔCt越高，mRNA表達(dá)越低，以2-△△CT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5Western印跡檢測OCT-4表達(dá) 收集用預(yù)冷的PBS洗滌3次的細(xì)胞，加適量RIPA及PMSF混合液裂解30 min，4 ℃離心5 min，取上清得細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE:蛋白樣品加上樣緩沖液混勻，95 ℃ 5 min變性后取50 μg蛋白上樣，壓縮膠70 V 20 min，濃縮膠100 V 60 min電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗(OCT-4的濃度為1∶800，內(nèi)參β-actin為1∶1 000)4 ℃過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1∶5 000)室溫孵育90 min，洗膜后進(jìn)行ECL法發(fā)光、顯影、定影。捷達(dá)凝膠系統(tǒng)分析各條帶積分光密度值(IOD)，以O(shè)CT-4的IOD/β-actin的IOD,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 收集細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，取100 μl接種7塊96孔板，邊緣孔以PBS填充，同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基和CCK-8，無細(xì)胞)，對(duì)照孔(培養(yǎng)基和細(xì)胞)，置37 ℃，5%CO2孵育過夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，4 h后測定490 nm各孔的吸光度值(A值)，連測7 d,以時(shí)間為橫軸，每天的A值為縱軸繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7克隆形成實(shí)驗(yàn) 制備單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，取100個(gè)細(xì)胞種于35 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 w，吸除培養(yǎng)液，甲醇固定15 min，吉姆薩染色液染色10 min，PBS洗滌，于顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)并記錄?？寺⌒纬陕?%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染效率的鑒定 轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，大于80%。見圖1。

2.2RT-PCR結(jié)果 以空白對(duì)照組A549細(xì)胞的bFGF mRNA表達(dá)水平為參照，質(zhì)粒干擾組及陰性對(duì)照組的mRNA相當(dāng)表達(dá)分別為(0.209±0.044)倍及(1.029±0.215)倍，干擾組明顯低于陰性及空白對(duì)照組(P<0.01)；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

2.3OCT-4蛋白的表達(dá)水平 質(zhì)粒干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組OCT-4蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.440±0.046、0.748±0.102、0.726±0.019，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，質(zhì)粒干擾組的OCT-4蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)。見圖2。

2.4細(xì)胞生長曲線圖 第1天各組細(xì)胞增殖沒有差別，第2～7天質(zhì)粒干擾組細(xì)胞生長明顯受抑，增殖活力明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(各P<0.01)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

1：空白對(duì)照；2：陰性對(duì)照組；3：質(zhì)粒干擾組

2.5抑制bFGF表達(dá)對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響 圖中單個(gè)紫色小點(diǎn)為一個(gè)克隆集落，質(zhì)粒干擾組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率分別為(12.25±2.97)%、(42.75±4.50)%、(44.25±3.31)%，質(zhì)粒干擾組克隆形成能力明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(各P<0.01),而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

圖4 轉(zhuǎn)染后各組A549細(xì)胞的克隆集落

3 討 論

bFGF作為bFGF/FGFR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，由定位于染色體4q 26～27基因編碼，因其上游起始密碼子的不同，可產(chǎn)生分子量在18～34 kD之間的多種異構(gòu)體，這些異構(gòu)體通過自分泌、旁分泌或者內(nèi)分泌的形式分泌，與細(xì)胞表面的受體接觸后通過PKC、Ras /Raf/MEK /ERK、PI3K等途徑將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展很多都和細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)異常密切相關(guān)，bFGF/FGFR信號(hào)通路作為眾多重要信號(hào)通路之一，不僅在維持胚胎干細(xì)胞〔1〕、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞〔2〕、神經(jīng)干細(xì)胞〔3〕等正常干細(xì)胞自我更新、多潛能分化等特性方面起重要作用外，而且在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、耐藥、抗凋亡及腫瘤新生血管形成等方面起重要作用。已有研究表明，bFGF在腦膠質(zhì)瘤〔4〕、乳腺癌〔5〕、黑色素瘤〔6〕、肝癌等〔7〕多種腫瘤中過表達(dá)。Zhao等〔8〕對(duì)肺癌組織及正常肺組織行免疫組化發(fā)現(xiàn)，80.9%肺癌組織表達(dá)bFGF，明顯高于正常肺組織，而且bFGF過表達(dá)預(yù)示著更差的總生存，說明bFGF在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子OCT-4已被證實(shí)可作為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物〔9〕,其在干細(xì)胞高表達(dá)，一旦干細(xì)胞分化，其表達(dá)迅速下降或不表達(dá)。OCT-4對(duì)腫瘤形成及發(fā)展也起重要作用，這種作用在乳腺癌〔10〕、肺癌〔11〕、前列腺癌〔12〕、口腔癌〔13〕等腫瘤干細(xì)胞中得到證實(shí)。Meng等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞系中約有45%的為腫瘤始發(fā)細(xì)胞，它們具有自我復(fù)制、成瘤等特性。Vera等〔15〕對(duì)多種人癌細(xì)胞系進(jìn)行化療藥物處理，發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞富集腫瘤干細(xì)胞。本研究檢測A549表達(dá)OCT-4。

由于bFGF容易變性降解、半衰期極短，限制了bFGF單克隆抗體的使用。而RNA干擾作為一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后沉默技術(shù)，其核心原理是將特異性同源雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，導(dǎo)致目的基因不表達(dá)或表達(dá)下降，由于其不影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，與反義寡核苷酸干擾技術(shù)相比，RNAi具有高度特異性、抑制效率高、可持久傳代等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因治療研究〔16〕。本研究通過RNA干擾可以有效抑制肺癌A549細(xì)胞中bFGF在mRNA水平的表達(dá)。Greber等〔17〕在人胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)bFGF通過調(diào)節(jié)TGF-β受體信號(hào)通路而維持Oct-4、Nanog和Sox2的表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新，本研究發(fā)現(xiàn)bFGF表達(dá)抑制后,A549細(xì)胞的增殖能力及自我更新能力降低，,推測可能bFGF被抑制后下調(diào)OCT-4表達(dá),影響肺癌A549中的干細(xì)胞的特性有關(guān)。總之，本研究通過應(yīng)用RNAi技術(shù)，不僅有效抑制肺癌A549細(xì)胞中bFGF的表達(dá)，而且證明bFGF信號(hào)通路被抑制可能通過下調(diào)OCT-4，抑制肺癌細(xì)胞的增殖及自我更新能力等干細(xì)胞特性。

4 參考文獻(xiàn)

1Dvorak P,Dvorakova D，Hampl A.Fibroblast growth factor signaling in embryonic and cancer stem cells〔J〕.FEBS Lett，2006；580(12)： 2869-74.

2Schmidt A，Ladage D，Schinklthe T，etal.Basic fibroblast growth factor controls migration in human mesenchymal stem cells〔J〕.Stem Cells，2006；24(7)：1750-8.

3王占堯,曹 磊,姬西團(tuán).bFGF和BDNF對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖分化的影響〔J〕.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2010；9(5):435-7.

4Wang DL,Wang YF,Shi GS,etal.Correlation of hTERT expression to maspin and bFGF expression and their significance in glioma〔J〕.Ai zheng,2007；26(6)：601-6.

5Fuksiewicz M,Kowalska M,Kotowicz B,etal.Serum soluble tumour necrosis factor receptor type I concentrations independently predict prognosis in patients with breast cancer〔J〕.Clin Chem Lab Med,2010；48(10)：1481-6.

6Fontijn D,Bosch LJ,Duyndam MC,etal.Basic fibroblast growth factor- mediated overexpression of vascular endothelial growth factor in IF6 human melanoma cells is regulated by activation of PI3K and p38 MAPK〔J〕.Cell Oncol,2009；31(3)：179-90.

7Wang XH,Sun X,Meng XW,etal.Beta-catenin siRNA regulation of apoptosis- and angiogenesis-related gene expression in hepatocellular carcinoma cells：potential uses for gene therapy〔J〕.Oncol Rep，2010；24(4)：1093-9.

8Zhao M,Gao FH,Wang JY，etal.JAK2/STAT3 signaling pathway activation mediates tumor angiogenesis by upregulation of VEGF and bFGF in non-small-cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2011；73： 366-74.

9Lengner CJ,Welstead GG,Jaenisch R.The pluripotency regulator Oct-4：a role in somatic stem cells〔J〕?Cell Cycle,2008；7(6):725-8.

10Bussolati B,Grange C,Sapio A,etal.Endothelial cell differentiation of human breast tumor progenitor cells〔J〕.J Cell Mol Med,2009； 13(2):309 -19.

11Chen YC,Hsu HS,Chen YW,etal.Oct-4 expression maintained CD133-positivrcell 〔J〕.PLoS One，2008；3(7):e2637.

12Gu G，Yuan J，Wills M，etal.Prostate cancer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo 〔J〕.Cancer Res，2007；67(10)：4807-15.

13Chiou SH,Yu CC，Huang CY，etal.Positive correlation of Oct-4 and Nanog in oral cancer stem-like cells and high-grade ora squamous cell carcinoma 〔J〕.Clin Cancer Res,2008；14(13)： 4085-95.

14Meng X,Wang X,Wang Y.More than 45%of A549 and H446 cells are cancer initiating cells：evidence from cloning and tumorigenic analyses 〔J〕.Onco Rep,2009； 21(4)：995-100.

15Vera Levina,Adele M,Marrangoni A，etal.Drug-selected human lung cancer stem cells：cytokine network,tumorigenic and metastatic properties 〔J〕.PloS One，2008；3(8):e3077.

16Kim DH，Rossi JJ.Strategies for silencing human disease using RNA inter- ference〔J〕.Nat Rev Genet，2OO7； 8(3)： 173-84.

17Greber B,Lehrach H，Adjaye J.Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signoling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs(hESCs)to support hESC self-renewal〔J〕.Stem Cells，2007；25(2)：455-64.