坐骨神經(jīng)卡壓對脊髓運動神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的影響

張增祥 任 寶 薛金偉 王曉東

(河北大學附屬醫(yī)院骨科，河北 保定 071000)

周圍神經(jīng)卡壓綜合征是外科常見疾病之一?？▔涸缙冢窠?jīng)內(nèi)缺血、缺氧導致水腫，隨著時間延長，神經(jīng)束內(nèi)血管進一步受壓導致神經(jīng)營養(yǎng)障礙，嚴重的引起瓦勒氏變性、束間黏連及永久性瘢痕，這是影響神經(jīng)傳導功能原因，也是選擇神經(jīng)內(nèi)、外松解及局部藥物治療的依據(jù)〔1〕。董震等〔2〕研究表明，大鼠坐骨神經(jīng)卡壓后脊髓前角運動神經(jīng)元及神經(jīng)節(jié)細胞可發(fā)生一系列超微結(jié)構(gòu)改變，并隨卡壓時間延長、卡壓程度加重而加劇甚至死亡，對臨床有很大指導作用。Ramon-Gueto等〔3〕表明神經(jīng)膠質(zhì)細胞對受損的神經(jīng)元有保護和修復作用。本文采用經(jīng)典坐骨神經(jīng)慢性卡壓模型〔4〕，于造模后不同時間取材，觀察對應脊髓節(jié)段前角運動神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞光鏡及超微結(jié)構(gòu)變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔SD大鼠50只(180～220 g)，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2模型制備與分組 經(jīng)典大鼠坐骨神經(jīng)慢性卡壓模型的制備〔4〕：1%巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺板上，左側(cè)為實驗側(cè)，右側(cè)為對照側(cè)，雙下肢后外側(cè)縱行切口顯露坐骨神經(jīng)，使用縱行剖開長10 mm、內(nèi)徑1.2 mm硅膠管于梨狀肌下緣0.5 cm處套在坐骨神經(jīng)上，9-0無創(chuàng)線縫合3針固定硅膠管，局部慶大霉素0.1ml縫合傷口，對照側(cè)只顯露坐骨神經(jīng)，術(shù)后雌雄分籠飼養(yǎng)。分組：按照術(shù)后取材時間將成功制作模型大鼠隨機分為5組，分別為12、18、24、30、36 w組，每組10只，光鏡組：n=8，電鏡組：n=2。

1.3取材和檢測指標

1.3.1取材 術(shù)后12、18、24、30、36 w，1%巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，開胸、降主動脈插管，下腔靜脈胸段剪開放血，25 U/ml肝素鹽水快速灌注至下腔靜脈流出液體為無色，改用2%戊二醛磷酸緩沖液150 ml灌流，后路取L4～6節(jié)段脊髓。分別于光鏡〔10%多聚甲醛(n=8)和電鏡下觀察(4%戊二醛磷酸緩沖液(n=2)〕固定。

1.3.2檢測指標

1.3.2.1一般情況 傷口愈合情況：有無足底潰瘍及自噬現(xiàn)象；大鼠毛色改變及肌萎縮狀況。

1.3.2.2大體改變 觀察局部坐骨神經(jīng)卡壓段神經(jīng)外膜增生及粘連狀況，卡壓近端神經(jīng)增粗情況；相應脊髓節(jié)段光澤度。

1.3.2.3光鏡觀察 HE、鋨酸染色，光鏡下(×100)計數(shù)左右側(cè)脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)目，計算側(cè)(左側(cè))與對照側(cè)(右側(cè))細胞數(shù)目之比(L/R)〔5〕。

1.3.2.4電鏡觀察 手術(shù)顯微鏡下選取脊髓前角部位，固定、脫水，包埋、切片，醋酸、枸櫞酸鉛雙染，日立H/7500透射電鏡觀察。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0 for windows軟件包，組內(nèi)配對t檢驗，組間采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 術(shù)后實驗動物傷口均Ⅰ期愈合，無感染及自噬現(xiàn)象；8 w后大鼠實驗側(cè)毛色發(fā)黃、失去光澤；12 w后，患足展趾功能受限，承重點移至膝關(guān)節(jié)，肌肉逐漸萎縮，無足底潰瘍發(fā)生。

2.2大體觀察 模型建立后各時間段脊髓外觀無明顯改變。各組在術(shù)后12、18、24、30、36 w均可見神經(jīng)與周圍粘連，增生結(jié)締組織從遠近兩端逐漸包裹硅膠管，卡壓遠、近端神經(jīng)增粗；30 w時近端增粗明顯，質(zhì)地變硬，結(jié)締組織包裹全部硅膠管，36 w包裹進一步增厚。

2.3光鏡觀察 圖1可見，實驗側(cè)與對照側(cè)比較，脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)目在12 w無明顯改變，在18、24、30、36 w分別減少7.46%、12.24%、16.83%、20.98%(P<0.05)(表1)，12、18、24、30、36 w脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)目之比分別為0.995 9±0.122，0.925 4±0.064，0.877 6±0.068，0.831 7±0.048，0.790 2±0.057。18 w觀察到“衛(wèi)星現(xiàn)象”， 30 w時在lamina Ⅸ前角運動α神經(jīng)元明顯減少。

2.4電鏡觀察 術(shù)后12 w可見線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，溶酶體數(shù)量增多，核仁明顯、染色質(zhì)分布均勻，呈常染色質(zhì)狀態(tài)；術(shù)后18 w，線粒體腫脹加劇，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進一步擴張，溶酶體數(shù)量減少，核仁明顯、深染，開始出現(xiàn)染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)異染色體；術(shù)后24 w，線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目減少，核仁明顯、深染，異染色質(zhì)增多，核周隙開始出現(xiàn)增寬，溶酶體數(shù)量明顯減少，′衛(wèi)星現(xiàn)象′清晰可見；術(shù)后30、36 w，線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進一步減少，核仁偏移消失，核周膜模糊，異染色質(zhì)邊集加重，溶酶體幾近消失，提示細胞功能退化、消失；術(shù)后30 w，神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)細胞器明顯減少，細胞膜結(jié)構(gòu)不清，異染色質(zhì)邊集。見圖2。

圖1 衛(wèi)星現(xiàn)象及前角運動α神經(jīng)元

表1 實驗側(cè)與對照側(cè)脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)目

圖2 電鏡觀察

3 討 論

在周圍神經(jīng)卡壓后存在逆向軸漿流受阻，如程度輕，早期仍可滿足神經(jīng)元的需求，神經(jīng)元并不發(fā)生死亡，僅在超微結(jié)構(gòu)上可發(fā)生一些異常，本實驗研究結(jié)果與之一致。分析其原因可能為：周圍神經(jīng)卡壓程度逐漸加劇，逆向軸漿流受阻不斷加重，導致靶器官對神經(jīng)的營養(yǎng)作用不斷減弱，而卡壓近端神經(jīng)側(cè)支及神經(jīng)膠質(zhì)細胞提供的神經(jīng)營養(yǎng)因子又不能代償，最終將不能滿足神經(jīng)元代謝的需要，發(fā)生一系列形態(tài)、生化、代謝、方面的改變，據(jù)軸突損傷的程度，這種反應輕重不一，其歸宿為：神經(jīng)元短期變性后恢復為正常的神經(jīng)元、神經(jīng)元潰變 、神經(jīng)元死亡〔6，7〕。

神經(jīng)組織由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，長期以來，人們只注意到膠質(zhì)瘢痕不利的一面，神經(jīng)變性通常導致反應性膠質(zhì)增生，此時膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，代謝活動加強，膠質(zhì)細胞及其突起可包圍損傷和變性的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，最終導致膠質(zhì)瘢痕形成，膠質(zhì)瘢痕妨礙神經(jīng)軸突再生，但神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)組織修復與再生都起著十分重要的作用，神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以合成和釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、層黏蛋白、纖維黏連蛋白以及其他細胞外基質(zhì)成分，有維持神經(jīng)元存活和促進神經(jīng)突起生長作用〔8〕。神經(jīng)膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的交互作用越來越引起人們的關(guān)注。許多實驗證明，在神經(jīng)變性、損傷早期膠質(zhì)細胞反應性增生可能具有修復功能，本實驗研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)卡壓18 w開始出現(xiàn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”是對損傷的一種反應。此時膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)因子，通過旁分泌作用于受損神經(jīng)元，維持神經(jīng)元存活，同時，神經(jīng)膠質(zhì)細胞能夠攝取突觸間隙的谷氨酸，再其獨有的谷氨酰胺酶的作用下將谷氨酸轉(zhuǎn)變成無毒的谷氨酰胺，改善缺血后神經(jīng)元的存活。晚期，膠質(zhì)細胞發(fā)揮清道夫作用，清除死亡細胞和碎片占據(jù)其殘空間，形成膠質(zhì)瘢痕，與本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致：在神經(jīng)卡壓30 w時，觀察到脊髓Lamina Ⅸ區(qū)運動神經(jīng)元幾近消失，代之以神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤，電鏡觀察神經(jīng)膠質(zhì)細胞器減少，細胞膜結(jié)構(gòu)不清、異染色質(zhì)邊集嚴重。究竟在神經(jīng)損傷后多長時間內(nèi)膠質(zhì)細胞可以生成和釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，持續(xù)多長時間，神經(jīng)膠質(zhì)細胞的修復作用何時轉(zhuǎn)變成抑制性屏障作用有待進一步研究。

4 參考文獻

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