乳腺小黏蛋白基因在檢測乳腺癌病人外周血微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用價值

劉平賢

(南陽市中心醫(yī)院乳腺分泌腺外科，河南 南陽 473000)

我國乳腺癌的發(fā)病率約占婦女腫瘤三分之一, 而且具有較高的死亡率〔1〕。遠處轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌的轉(zhuǎn)移模式并非固定不變的,早期乳腺癌亦有隱匿性轉(zhuǎn)移〔2〕。故早期檢測外周血微轉(zhuǎn)移對該病的有效治療及評判預(yù)后意義重大。本文以乳腺小黏蛋白(SBEM)基因作為檢測指標(biāo), 分析乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞及其在微轉(zhuǎn)移檢測中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本院2011年2月至2012年11月111例乳腺癌病人外周血標(biāo)本。年齡30～79歲, 平均(46.4±16.5)歲。根據(jù)乳腺癌組織學(xué)類型劃分: 99例浸潤性導(dǎo)管癌, 7例浸潤性小葉癌, 4例黏液癌, 1例單純癌。TNM分期情況: 21例Ⅰ期, 75例Ⅱ期, 15例Ⅲ期。孕激素受體(PR)陽性及陰性分別為46例與65例; 雌激素受體(ER)陽性及陰性分別為69例與42例。此外，對照組選擇18例女性結(jié)/直腸癌、24例女性胃癌、42例女性乳腺纖維腺瘤病人以及29例女性健康志愿者的外周血標(biāo)本。全部病人均通過臨床病理學(xué)確診, 乳腺癌病人術(shù)前胸片X線檢查、CT、B超以及骨掃描等未見轉(zhuǎn)移灶。

1.2儀器與耗材 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀為美國PE公司生產(chǎn); 凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn); 分光光度計為上海第二分析儀器公司生產(chǎn); 淋巴細胞分離液購自天津TBD公司; 核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒均購自Promega公司; Taq DNA聚合酶購自MBI公司; 核酸染料EB購自華美公司; DNA 分子量標(biāo)記購自Sangon公司。

1.3引物設(shè)計 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計引物, 合成工作委托上海生工完成。SBEM mRNA首輪PCR左引物序列: 5′-TAGCAGTCCTGGTACTCTTGG-3′; 右引物序列: 5′-AGCTGATTCCATCTCAGGGAC-3′, PCR產(chǎn)物長度為276 bp; 第二輪PCR左引物序列: 5′-TGCCCAGAATCCGACAACA-3′; 右引物序列: 5′-GCAGTGGTCGCAGTGGTTG-3′, PCR產(chǎn)物長度為114 bp。

1.4收集標(biāo)本及核酸提取 全部病人采血前均未實施輔助治療。采5 ml外周血, 通過EDTA抗凝處理, 淋巴細胞分離液獲得單個核細胞。根據(jù)試劑盒步驟在0.5 h內(nèi)抽提組織總RNA。分光光度計檢測RNA的純度, 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解。

1.5RT-PCR擴增 根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書步驟實施基因擴增。RT-PCR總反應(yīng)體系為20 μl, 包括AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.7 μl, mRNA模板2 μl, MgCl2(25 mmol/L)4 μl, dNTPs 2 μl, 10×緩沖液 2 μl, 核酸酶抑制劑0.5 μl, Oligo(dT) 151 μl, 去核酶水7.8 μl。在42℃條件下逆轉(zhuǎn)錄15 min; 逆轉(zhuǎn)錄酶在95℃下熱變性5 min。首輪PCR總反應(yīng)體系為25 μl, 包括cDNA 1 μl, 10×緩沖液 2.5 μl, MgCl2(25 mmol/L) 2 μl, DNA聚合酶0. 2 μl, dNTPs 0.5 μl, 左、右引物各為1 μl, 去核酶水16.8 μl。循環(huán)條件為預(yù)變性94℃, 4 min; 共32次循環(huán)擴增, 94℃, 45 s變性; 54℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最后延伸72℃ 5 min。第二輪PCR取首輪PCR產(chǎn)物1 μl作為擴增模板, 加第二輪PCR左、右引物各1 μl。擴增條件為94℃預(yù)變性 5 min; 共32次循環(huán)擴增, 94℃, 45 s變性; 57℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最終72℃延伸10 min。使用100 bp DNA 梯度作為分子量標(biāo)記, 在濃度為2%的瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外光下觀察并記錄結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1測序結(jié)果 所擴增的SBEM基因片段序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫并通過BLAST程序，進行同源性比對后證實所得產(chǎn)物即為SBEM基因的部分序列。

2.2外周血中SBEM基因的表達情況 乳腺癌組外周血陽性表達率〔53.15%(59例)〕與乳腺纖維腺瘤組(0)、健康組(0)、胃癌組(0)和結(jié)直腸癌組(0)相比差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3SBEM基因陽性表達與乳腺癌病理學(xué)特征的相關(guān)性 SBEM基因的陽性表達與病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期之間具有相關(guān)性(P<0.01); 而與病人年齡大小、病理類型、原發(fā)腫瘤體積、ER以及PR等無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 SBEM基因在乳腺癌外周血的陽性表達及病理學(xué)特征的相關(guān)性〔n(%)〕

3 討 論

目前我國乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居首位〔3〕。文獻報道稱乳腺癌發(fā)病早期即存在微轉(zhuǎn)移〔4，5〕。血液循環(huán)系統(tǒng)中的癌細胞是造成腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的主要誘因, 故而盡早查出外周血中的腫瘤細胞不但對防范復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有重大潛在價值, 而且對腫瘤病人的臨床治療意義重大。

關(guān)于乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢測, 尚無靈敏度高的分子標(biāo)記。故選用特異性高的指標(biāo)基因是確保微轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵所在〔6〕。SBEM的基因定位在染色體12q上, 它由3條8個氨基酸的短肽前后重復(fù)的疏水核心構(gòu)成, 與唾液黏蛋白結(jié)構(gòu)相似。SBEM基因的表達呈現(xiàn)出明顯的特異性, 僅表達于乳腺及唾液腺中, 具有高度的特異性, 特別適用于檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移, 提倡作為早期診斷乳腺癌的分子標(biāo)記。

RT-PCR具有較高的敏感度, 可在1×106～1×107個正常細胞中分辨出一個腫瘤細胞〔7〕。在外周血中腫瘤細胞檢測方面, RT-PCR能夠擴增出腫瘤細胞中標(biāo)志性的靶基因來說明外周血中存在腫瘤細胞, 已被普遍應(yīng)用于檢測各種實體瘤微轉(zhuǎn)移〔8〕。本研究因存在大量RNA酶, 血漿中無游離的mRNA, 故經(jīng)RT-PCR方法檢測出的SBEM mRNA必然源于外周血中完整的循環(huán)細胞, 而且正常乳腺細胞以及乳腺良性腫瘤細胞是不能進入外周循環(huán)的, 而乳腺癌細胞外則可以進入外周循環(huán), 故SBEM mRNA陽性則提示血液循環(huán)中存在乳腺癌細胞〔9〕。

本研究說明SBEM基因在檢測乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細胞方面的特異性較高。SBEM基因表達的陽性率隨TNM分期呈正相關(guān)。這與惡性腫瘤細胞的生物學(xué)行為相一致。此外，本研究表明Ⅰ及Ⅱ期乳腺癌病人可能存在血循環(huán)微轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。不是全部乳腺癌病人外周血中均可檢測出SBEM mRNA表達。這表明腫瘤細胞是成簇且不連續(xù)地進入血液循環(huán)中的, 故增加取血次數(shù)及一次取血量將增大陽性率。腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

總之，外周血中SBEM mRNA表達的陽性率在某種程度上可以反映出臨床病期, 對指導(dǎo)臨床治療以及評判預(yù)后具有重要價值，但仍需對病人進行長期隨訪, 以明確微轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后之間的相關(guān)性。

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