辛伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠血清腫瘤壞死因子α及一氧化氮表達(dá)的影響

俞國(guó)峰 鄭 霞 方 強(qiáng)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,浙江 杭州 310003)

目前認(rèn)為，多種炎癥因子在膿毒癥的形成和發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用，如腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1，-6，-8等〔1〕。炎癥因子的過(guò)量生成可激活巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS),產(chǎn)生和釋放大量一氧化氮(NO)，而NO和細(xì)胞因子參與了膿毒癥時(shí)低血壓和組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。臨床研究顯示，他汀類藥物不但有降脂作用，還可以抑制炎性因子的釋放，抑制炎性細(xì)胞的黏附，降低膿毒血癥的發(fā)生率和病死率〔2〕。本實(shí)驗(yàn)旨在探討辛伐他汀對(duì)膿毒癥大鼠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥品和試劑 健康成年雄性SD大鼠96只,體重280～320 g,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。辛伐他汀片，20 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司。TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。NO試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)分組、給藥方法及模型建立 96只雄性SD大鼠按照隨機(jī)排列表法分為:正常對(duì)照組、盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)組、辛伐他汀組,各32只。正常對(duì)照組用淀粉20 mg·kg-1·d-1加入2 ml生理鹽水制成混懸液灌胃5 d，術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下取下腹正中切口2 cm，翻動(dòng)盲腸后還納腹腔，逐層縫合切口，置籠內(nèi)活動(dòng)，不禁飲食。CLP組術(shù)前灌胃與正常對(duì)照組相同，采用CLP手術(shù)制作膿毒癥大鼠模型〔3〕。辛伐他汀組用研缽粉碎辛伐他汀，以20 mg·kg-1·d-1加入2 ml生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，并采用CLP手術(shù)制作膿毒癥大鼠模型。

1.3標(biāo)本收集及測(cè)定 各時(shí)間組大鼠分別在術(shù)后各自時(shí)間點(diǎn)從大鼠頸動(dòng)脈采血，在采血管中靜置30 min，4℃以4 000 r/min離心15 min，分離出血漿后于-80℃冰箱中保存待測(cè)。并記錄術(shù)后5 d各組大鼠的生存情況。TNF-α用放免法測(cè)定,NO用硝酸還原酶法測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α和NO水平比較 正常對(duì)照組在在各時(shí)間點(diǎn)的TNF-α及NO無(wú)顯著差異。三組在術(shù)后0 h的血清TNF-α及NO無(wú)顯著差異，CLP組術(shù)后6 h、12 h、24 h的血清TNF-α及NO顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。辛伐他汀組在術(shù)后6 h、12 h、24 h的TNF-α、NO較正常對(duì)照組升高(P<0.05)，但同CLP組比較，均明顯降低(P<0.05)。CLP組和辛伐他汀組術(shù)后12 h TNF-α達(dá)高峰,NO水平在觀察時(shí)間段內(nèi)術(shù)后24 h為最高峰。見(jiàn)表1，表2。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清NO水平

2.2三組大鼠術(shù)后存活率比較 術(shù)后5 d正常對(duì)照組大鼠均存活，存活率100%，CLP組大鼠存活4只，存活率12.50%，辛伐他汀組存活18只，存活率56.25%，辛伐他汀組存活率明顯高于CLP組(P<0.05)。

3 討 論

研究〔4，5〕顯示，他汀類藥物能通過(guò)“多效應(yīng)”機(jī)制改善膿毒癥模型和患者的預(yù)后，其中最重要的就是抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕其所致的“炎癥瀑布”。目前認(rèn)為TNF-α是內(nèi)毒素刺激后最先表達(dá)的細(xì)胞因子，它可進(jìn)一步誘導(dǎo)自身和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，直接抑制心肌和血管平滑肌，促進(jìn)微血栓形成等，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔6～8〕。因此抑制膿毒癥是TNF-α的表達(dá)可能起到阻斷膿毒癥發(fā)展的作用。本研究結(jié)果表明，TNF-α參與了膿毒癥的病理生理過(guò)程。對(duì)于該因子各時(shí)相的變化，一方面可能與TNF-α的半衰期較短有關(guān)，另一方面可能與內(nèi)毒素的濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還說(shuō)明辛伐他汀在膿毒癥時(shí)抑制了TNF-α的表達(dá)，證明辛伐他汀對(duì)膿毒癥的抗炎作用。辛伐他汀的主要作用是降脂，但目前認(rèn)為它對(duì)心腦血管疾病的保護(hù)作用是源自它的非降脂作用，其中最主要的是其抗炎效應(yīng)〔9〕。目前對(duì)于辛伐他汀對(duì)TNF-α的抑制作用機(jī)制尚不明確，認(rèn)為可能與辛伐他汀對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路上對(duì) G蛋白的鈍化，影響絲裂原激活的蛋白激酶，磷脂酰肌醇-3 激酶，細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)系統(tǒng)的活性有關(guān)〔10〕。

膿毒癥時(shí)在大量炎癥因子在多種炎癥介質(zhì)刺激下，產(chǎn)生大量的NO，大量的NO 及其代謝產(chǎn)物超氧亞硝酸鹽具有細(xì)胞毒性作用,使血管平滑肌松弛、血管擴(kuò)張，并導(dǎo)致心肌收縮力下降，血管壁通透性增加，大動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能受損，線粒體呼吸鏈電子傳遞受抑制等作用，最終導(dǎo)致多臟器功能衰竭。因此抑制膿毒癥時(shí)NO的過(guò)量生成，可以減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，預(yù)防多臟器功能衰竭的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明在膿毒癥時(shí)血清NO濃度升高明顯。本研究還提示辛伐他汀能夠抑制膿毒癥大鼠血清NO水平。

目前他汀類藥物對(duì)膿毒癥時(shí)血清NO的可能調(diào)節(jié)機(jī)制主要通過(guò)：降低膿毒癥時(shí)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)：研究證實(shí)它是通過(guò)TNF-α、IL-1β等刺激細(xì)胞,由細(xì)胞內(nèi)NF-κB系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子通路調(diào)控合成的〔11〕。高和活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平：眾多的實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)提示他汀類藥物通過(guò)恢復(fù)磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3-K)膜轉(zhuǎn)位水平激活PI3-K〔12〕，活化的PI3-K使其下游的Akt磷酸化eNOS活化。另外，研究顯示他汀類藥物通過(guò)影響小窩蛋白功能增加eNOS合成〔13〕。因此,他汀類藥物能增加eNOS表達(dá)水平的同時(shí)抑制iNOS合成,恢復(fù)eNOS與iNOS的動(dòng)態(tài)平衡,保持血清NO的正常水平，從而保護(hù)了內(nèi)皮的完整功能〔14〕，避免膿毒癥時(shí)NO的過(guò)度表達(dá)引起的內(nèi)皮功能損傷而導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的病理生理變化。

本實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后5 d存率結(jié)果提示辛伐他汀組具有抗膿毒癥的作用,可以提高CLP膿毒癥大鼠的生存率。Merx等〔15〕采用CLP手術(shù)制膿毒癥大鼠模型，預(yù)先用他汀類藥物處理過(guò)的小鼠的平均存活率是CLP組的4倍。不僅動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，Kruger 等〔16〕對(duì)438例患者中66例(占總?cè)巳旱?5%)入院前正在服用他汀類藥物，而且其中85%患者入院后仍繼續(xù)接受他汀類藥物治療進(jìn)行的回顧性調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物治療對(duì)膿毒癥患者有益，他汀治療組與CLP組相比，28 d總病死率和由膿毒癥所致的病死率顯著下降。

本研究顯示膿毒癥時(shí)血清TNF-α和NO的水平升高，參與了膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，辛伐他汀能夠抑制膿毒癥大鼠血清TNF-α和NO的水平，從而阻斷其過(guò)量生成所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，從而提高CLP膿毒癥大鼠的5 d生存率。但辛伐他汀是否也影響抗炎介質(zhì)的生成，膿毒癥的量效關(guān)系，不同給藥方式是否有影響，均有待進(jìn)一步研究。

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