羅布麻提取物對ox-LDL誘導(dǎo)U937形成泡沫細(xì)胞過程中TNF-α表達(dá)的影響

巨名飛 王智昊 賈立立 黃賢勝 王瑞鵑 張愛文 鄭 楊

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟科，河北 承德 067000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)伴隨其發(fā)展始終〔1〕。炎癥因子和炎細(xì)胞間相互作用是AS發(fā)病機(jī)制的核心。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是致AS的獨(dú)立危險因素，它廣泛參與了致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、促使泡沫細(xì)胞形成、促進(jìn)血小板聚集等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，構(gòu)成AS病變的起始階段〔2〕，同時其還發(fā)揮類似于前炎癥介質(zhì)的作用，誘導(dǎo)AS中的炎細(xì)胞表達(dá)和分泌炎癥因子，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)。研究顯示它可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子(TNF-α)，加速AS的進(jìn)程〔3,4〕。羅布麻(AV)具有降壓、降脂、延緩衰老等功效。近年研究發(fā)現(xiàn)AV對AS也有一定的防治作用。本實(shí)驗(yàn)以ox-LDL誘導(dǎo)的U937細(xì)胞形成的泡沫細(xì)胞為AS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察AV對ox-LDL誘導(dǎo)U937細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞過程中TNF-α表達(dá)的影響，旨在說明AV通過抑制炎癥因子發(fā)揮抗AS作用。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑 AV提取物購自西安奧晶科技發(fā)展有限公司。佛波酯購自Sigma公司。人TNF-α定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。RPMI- 1640培養(yǎng)基和Trizol購自Gibco公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo(dT)購自Promega公司。引物由上海生工合成。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2LDL的純化、氧化修飾及鑒定 采集健康成人空腹12 h后新鮮混合靜脈血，加入100 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用超速離心法42 000 r/m離心獲得LDL提取液，經(jīng)瓊脂糖電泳顯示為單一蛋白帶。將LDL置于含10 μmol/ L CuSO4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液(pH 7.4)中，37℃溫育24 h。氧化后的LDL置含200 μmol EDTA的PBS中透析24 h，PBS再透析24 h，過濾除菌后4℃保存。LDL中的脂過氧化物在氧化過程中增加，顏色也逐漸變淺。瓊脂糖電泳顯示，ox-LDL 的電泳遷移速率快于未氧化的LDL。

1.3U937細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 人U937單核細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)免疫教研室饋贈。細(xì)胞懸浮樣生長于含10%高溫滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3天換液1次。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 每次實(shí)驗(yàn)前用100 nmol/L佛波酯(PMA)孵育U937單核細(xì)胞72 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，換無血清24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后加處理因素。將細(xì)胞隨機(jī)分為五組，對照組：U937巨噬細(xì)胞置于無血清24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)中。模型組(ox-LDL)：在U937巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入ox-LDL 100 mg/L〔3,4〕，AV低濃度組(AV1)：在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入AV提取物(0.2 mg/L)，然后加入ox-LDL 100 mg/L。AV中濃度組(AV2)：在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入AV提取物的濃度為0.4 mg/L。AV高濃度組(AV3)：在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入AV提取物的濃度為0.8 mg/L。各組設(shè)3個復(fù)孔，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5ELISA檢測TNF-α蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞上清液；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔(8孔)，每孔中各加樣品稀釋液100 μl，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μl,混勻后用加樣器吸出100 μl，移至第2孔。如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔，最后，從第七孔中吸出100 μl棄去，使體積均為100 μl。第8孔為空白對照；加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品100 μl；將反應(yīng)板置加入37℃ 120 min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙尚印干；每孔中加入第一抗體工作液50 μl；將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 60 min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙尚印干；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl；將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 60 min；洗板：同前；每孔加入底物工作液100 μl，置37℃暗處反應(yīng)5～10 min；在492 nm處測吸光值，記錄結(jié)果。

1.6RT-PCR檢測TNF-α mRNA的表達(dá) 收集兩組細(xì)胞，TrIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計(jì)測定A260/A280 的比值在1.8～2.0 之間。分別取1 μg RNA 在20 μl反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;取5 μl cDNA 于50 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增TNF-α引物，上游:5′-ATGAGCAGAAAGATGATC-3′,下游：5′-TACAGGCTTGTCACGAATT-3′(298 bp)。內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，上游:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游：5′-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3′(450 bp)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴乙啶)3 V/cm電泳分離,對電泳條帶進(jìn)行掃描定量分析并攝像,應(yīng)用作為GAPDH內(nèi)參照。TNF-α mRNA 表達(dá)分析:采用Image Master VDS進(jìn)行光密度掃描(IOD) ,以TNF-α各組條帶和相應(yīng)GAPDH條帶的IOD 比值表示TNF-α表達(dá)的強(qiáng)弱。

2 結(jié) 果

2.1U937單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡下U937細(xì)胞呈圓形、懸浮狀態(tài)，經(jīng)100 nmol/L PMA誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?、橢圓形或不規(guī)則形，由懸浮變?yōu)橘N壁狀態(tài)，且伸展偽足，細(xì)胞體積增大，表明已經(jīng)分化為巨噬細(xì)胞。再與100 mg/L ox-LDL孵育后油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)含許多紅色脂類顆粒物質(zhì)，提示AS泡沫細(xì)胞模型制備成功。

2.2ELISA方法檢測TNF-α蛋白的表達(dá)結(jié)果 ox-LDL組〔(90.82±11.58)pg/ml〕較對照組〔(38.70±2.90)pg/ml〕TNF-α分泌量明顯增加，三組不同濃度的AV提取物〔(66.21±5.79)、(63.31±4.34)、(51.73±4.34)pg/ml〕與ox-LDL組比較TNF-α 含量減少(P<0.05)。且隨AV濃度的增加TNF-α表達(dá)呈逐漸下降趨勢。

M:Marker, 1,6：對照組；2,7:ox-LDL組；3,8：AVI組：4，9：AV2組：5，10：AV3組

2.3RT-PCT檢測TNF-α基因 對照組中TNF-α條帶顏色較淺〔光密度比值(0.23±0.02)ratio〕，ox-LDL作用U937M 24 h后條帶顏色明顯加深〔(1.12±0.04)ratio〕；加用不同濃度的AV后，TNF-α條帶顏色比ox-LDL組變淺〔光密度比值分別為(0.83±0.03)、(0.56±0.04)、(0.44±0.04)ratio〕。ox-LDL組與C組比較TNF-α表達(dá)明顯增加(P<0.05)，這與ELISA結(jié)果基本一致。見圖1。

3 討 論

AS是現(xiàn)代社會嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，但至今其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是炎癥損傷學(xué)說即AS是一種炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)伴隨其發(fā)展始終。

ox-LDL是致AS的獨(dú)立危險因素，具有細(xì)胞毒性，可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起內(nèi)皮功能障礙，產(chǎn)生促AS發(fā)生的環(huán)境〔6〕；趨化單核細(xì)胞并誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成；抑制巨噬細(xì)胞重新返回血液循環(huán)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡；促進(jìn)粥樣斑塊的破裂和血栓形成；誘導(dǎo)自身抗體與其形成循環(huán)免疫復(fù)合物，促進(jìn)AS發(fā)生。此外，ox-LDL可作為炎癥過程中潛在的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)AS中主要細(xì)胞表達(dá)一些炎性因子、趨化因子的表達(dá)〔7〕如單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、白細(xì)胞介素(IL)-1等。由于生物連鎖反應(yīng)，這些因子又可刺激炎細(xì)胞，形成正反饋級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，加速AS的發(fā)展，導(dǎo)致心血管不良事件的發(fā)生。單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的主要來源〔8〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明ox-LDL趨化單核細(xì)胞并誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成同時，還可發(fā)揮類似于前炎癥介質(zhì)的作用，刺激炎癥因子的表達(dá)。這可能是其致AS形成的重要機(jī)制之一。

TNF-α是一種主要由巨噬細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和誘發(fā)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。大量研究表明它是AS中重要的炎癥因子，參與AS發(fā)生、發(fā)展的過程，研究表明它可直接作用于血管內(nèi)皮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，啟動AS過程；它還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子和其他炎癥介質(zhì)，來促進(jìn)白細(xì)胞、單核細(xì)胞等與血管內(nèi)皮的黏附聚集，增強(qiáng)局部的炎癥反應(yīng)； 趨化、活化單核細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移；促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子(TF)，啟動凝血過程；干擾脂質(zhì)代謝和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)新血管和血栓形成，加速AS的發(fā)生發(fā)展〔9〕。

抗感染治療是AS新的研究方向，AV是主要分布于我國西北鹽堿和沙漠地區(qū)的多年生夾竹桃科植物，其蘊(yùn)含多種有益于心血管疾病的活性成分如黃酮類、苷元、有機(jī)酸等〔5〕。有研究〔10〕表明，AV可抑制ox-LDL參與AS過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AV對AS的預(yù)防和治療有一定作用，其抗AS作用機(jī)制可能是通過抑制AS中炎性因子的表達(dá)和分泌，減輕炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。AV在AS中的具體作用途徑尚需進(jìn)一步研究。

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