養(yǎng)壽丹對 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及NGF、TrkA蛋白表達(dá)的影響

興桂華 吳淑琴 官 杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

老年性癡呆病亦稱阿爾茨海默病(AD)，是發(fā)生于老年期或老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以進(jìn)行性記憶和后天獲得的知識喪失，直到最后喪失生活能力為特征。神經(jīng)生長因子(NGF)是一種最早被發(fā)現(xiàn)、研究最為透徹的神經(jīng)肽類物質(zhì)，具有營養(yǎng)和保護(hù)膽堿能神經(jīng)的作用。研究〔1〕表明，NGF缺乏是AD發(fā)生的機(jī)制之一。因此，探索NGF表達(dá)機(jī)制對于AD等神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。NGF可通過高親和力酪氨酸激酶A(TrkA)受體介導(dǎo)以發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，AD早期即可現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元TrkA受體的表達(dá)下降〔2〕，改善TrkA受體的治療可能會減慢膽堿能神經(jīng)元退化速度〔3〕。本實(shí)驗(yàn)采用腦基底核內(nèi)立體定向聯(lián)合注射β-淀粉樣蛋白酶(Aβ1～40)和興奮性氨基酸建立AD動(dòng)物模型，以養(yǎng)壽丹進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察養(yǎng)壽丹對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織NGF、TrkA蛋白表達(dá)的影響，旨在探討?zhàn)B壽丹改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雄性SD大鼠100只，鼠齡8～12 w，體重(280±20)g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證編號SCXK(吉)2011-0004。

1.1.2藥物與主要試劑 養(yǎng)壽丹組成：何首烏、熟地、巴戟、枸杞子、川斷、牛膝、肉蓯蓉、茯苓、菟絲子、白術(shù)、遠(yuǎn)志、石菖蒲，上述藥材均購自安國市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，處方中各味藥比例為3∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1∶1〔4〕。加水煎煮2次，第1次3 h，第2次2 h，合并煎液，濾過，濃縮液含生藥5.6 g/ml， 貼標(biāo)簽后將藥液貯存于4℃保存?zhèn)溆?。Aβ1～40為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。鹽酸多奈哌齊片由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，產(chǎn)品批號110917A。鵝膏蕈氨酸(IBO,Sigma公司)，均為分析純。Rabbit Anti-NGF、Rabbit Anti-TrkA抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，SP即用型試劑盒及二氨荃聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購于福州生物技術(shù)公司。

1.1.3主要儀器 Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，江灣Ⅰ型C立體定向器(第二軍醫(yī)大學(xué))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)對照組、模型組、鹽酸多奈哌齊對照組(西藥對照組)和養(yǎng)壽丹組，每組20只。造?！?〕：將實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后，常規(guī)備皮消毒，沿顱頂中線切開頭皮，切口約2 cm，分離骨膜暴露頭骨，以前囟門為基點(diǎn)，由前囟向后0.5 mm，再從正中向右移至2.8 mm處，用牙科鉆打開顱骨，垂直插入微量注射器,使針尖自腦表面進(jìn)針7 mm至Myenert核，將1 μl溶液(內(nèi)含Aβ1～404 μg和IBO 1 μg，溶于生理鹽水)混合液緩慢注入，20 min內(nèi)分4次注射完畢，留針5 min，縫合皮膚。模型組、鹽酸多萘哌齊組、養(yǎng)壽丹組分別注射1 μl Aβ1～40和Iboteni cacid的混合液。用同樣方法假手術(shù)組注射生理鹽水1 μl。

1.2.2給藥方法 造模后第3天開始給予藥物干預(yù)，根據(jù)人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量。空白對照組、假手術(shù)對照組、模型組均按0.5 ml/100 g體重給予生理鹽水灌胃，1次/d，鹽酸多奈哌齊對照組按0.33 mg·kg-1·d-1，養(yǎng)壽丹組(含5.6 g生藥/ml)給藥，灌胃方法同模型組，連續(xù)2個(gè)月。

1.2.3Morris水迷宮試驗(yàn) 給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮行為測試。水迷宮為一不銹鋼圓形水池，直徑150 cm，高60 cm，內(nèi)置有機(jī)玻璃平臺，平臺高40 cm，底面為6 cm×10 cm。在水池壁東、西、南、北部位分別標(biāo)明入水點(diǎn)。將平臺放在西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm，水溫(22±1)℃，加適量奶粉使水呈乳白色，訓(xùn)練期間環(huán)境安靜，迷宮外參照物不變。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)前5 d為定位航行試驗(yàn)，用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。每天從東入水點(diǎn)頭朝池壁將大鼠放入水池，第1天讓大鼠自由游泳2 min；從第2天起，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺時(shí)所需時(shí)間(即潛伏期)，每次訓(xùn)練間隔60 s。自動(dòng)攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找平臺的時(shí)間(逃避潛伏期)，設(shè)定2 min為最長逃避潛伏期，2 min后自動(dòng)停止記錄。如果大鼠在2 min未找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其到平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中，記錄時(shí)間為2 min。實(shí)驗(yàn)第6天為空間探索試驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺，記錄在2 min內(nèi)跨過原平臺位置的次數(shù)。

1.2.4免疫組化檢測NGF 、TrkA蛋白表達(dá) 行為學(xué)測試完成后，每組隨機(jī)選6只大鼠斷頭處死，快速取出腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，厚約4 μm。采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，主要步驟：切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫25 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。用5%胎牛血清(BSA)封閉液室溫封閉20 min，滴加Rabbit Anti NGF (稀釋度1∶100)、Rabbit Anti-TrkA(稀釋度1∶100)，4℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 20 min，滴加鏈酶卵蛋白37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，以上各步驟均用0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次。顯色后常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察，棕黃色著色處為陽性。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對大腦海馬NGF、TrkA陽性細(xì)胞進(jìn)行測量分析每個(gè)統(tǒng)計(jì)場的積分光密度，每組6例大鼠，每張切片觀察5個(gè)視野。

2 結(jié) 果

2.1養(yǎng)壽丹對大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的影響 在5 d的定位航行試驗(yàn)中，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體上呈現(xiàn)下降趨勢，而模型組大鼠平均潛伏期下降速度相對較慢，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在第2、3、4、5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；養(yǎng)壽丹組和鹽酸多奈哌齊對照組大鼠平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)。見表1。

2.2養(yǎng)壽丹對大鼠空間探索跨越原平臺次數(shù)的影響 第6天的空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠跨越原平臺次數(shù)〔(1.70±1.30)次〕較空白對照組〔(15.35±1.39)次〕明顯減少(P<0.05)，與模型組比較，養(yǎng)壽丹組〔(4.00±1.65)次〕和鹽酸多奈哌齊對照組〔(5.05±1.73)次〕大鼠跨越原平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)。假手術(shù)對照組為(5.85±1.42)次。

表1 養(yǎng)壽丹對大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的影響

2.3養(yǎng)壽丹對各組大鼠海馬區(qū)NGF、TrkA表達(dá)的影響 光鏡下觀察NGF蛋白免疫組化反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色，呈胞質(zhì)著色。TrkA蛋白陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色，胞漿質(zhì)核均有著色。與假手術(shù)對照組比較,模型組海馬區(qū)NGF、TrkA積分光密度降低(P<0.05)；與模型組相比，假手術(shù)對照組、鹽酸多奈哌齊對照組及養(yǎng)壽丹組海馬區(qū)NGF、TrkA積分光密度增高(P<0.05)。見表2，圖1，圖2。

表2 養(yǎng)壽丹對各組大鼠海馬區(qū)TrkA、NGF表達(dá)的影響

圖1 各組大鼠海馬區(qū)NGT表達(dá)(×200)

3 討 論

學(xué)習(xí)記憶障礙是AD主要臨床癥狀和特征，因此，對學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行評價(jià)是觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標(biāo)之一〔6〕。經(jīng)典、較為穩(wěn)定的學(xué)習(xí)記憶檢測方法包括迷宮法、跳臺法、避暗法、穿梭法等，在一定程度上反映動(dòng)物對空間位置的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)尋找不透明水中隱藏平臺的操作過程，是國內(nèi)外公認(rèn)的檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶理想而有效的測試方法〔7〕，已被廣泛用于研究AD海馬記憶損傷的效果和藥物療效的評價(jià)〔8〕。本研究結(jié)果表明養(yǎng)壽丹對模型大鼠的學(xué)習(xí)障礙具有改善作用，提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

NGF是一種由118個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，為最早被發(fā)現(xiàn)、研究最為透徹的神經(jīng)營養(yǎng)因子，也是維持神經(jīng)系統(tǒng)功能重要的生物活性分子之一。NGF選擇性作用于大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)的膽堿能神經(jīng)元，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的分化、生長和發(fā)育,可促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)與再生，促進(jìn)異常神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，NGF缺乏是AD發(fā)生的機(jī)制之一，認(rèn)為NGF的異常表達(dá)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的障礙或NGF轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受阻參與了AD病理生理過程。NGF在海馬和大腦皮質(zhì)合成后，通過與其特異性TrkA受體結(jié)合，并逆行運(yùn)輸?shù)交浊澳X膽堿能神經(jīng)元后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TrkA受體是由原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，是神經(jīng)元細(xì)胞膜上 NGF 的高親和力受體。研究〔2〕發(fā)現(xiàn)，AD的早期階段即出現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元TrkA受體的表達(dá)下降,改善TrkA受體的治療可能會減慢膽堿能神經(jīng)元退化速度〔3〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示聯(lián)合注射Aβ1～40和興奮性氨基酸可造成大鼠神經(jīng)元的功能受損，神經(jīng)信號傳遞發(fā)生障礙。由于NGF水平不足可直接影響神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，造成神經(jīng)元功能受損，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生〔10〕。TrkA受體缺乏可引起NGF依賴性細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，造成神經(jīng)營養(yǎng)支持的缺乏，在某種程度上促使了膽堿能神經(jīng)元的退變,從而引發(fā)AD的相關(guān)癥狀。養(yǎng)壽丹組NGF、TrkA蛋白表達(dá)均較模型組增高，提示養(yǎng)壽丹能夠增加海馬區(qū)NGF、TrkA蛋白表達(dá)，對膽堿能神經(jīng)元起到保護(hù)和修復(fù)作用，進(jìn)而改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

4 參考文獻(xiàn)

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