腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織CREB、C/EBP的DNA結(jié)合活性改變

張泓波 高維娟 錢 濤 唐敬龍 李 君

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

腦缺血再灌(I/R)注既可挽救瀕死的細(xì)胞，又可加重缺血細(xì)胞的損傷，引起腦缺血再灌注損傷〔1〕而導(dǎo)致癡呆。學(xué)習(xí)和記憶中樞位于海馬，CA1區(qū)是腦缺血再灌注損傷的敏感區(qū)域。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)(cAMP)元件結(jié)合蛋白(CREB)是細(xì)胞核內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，可調(diào)控多種基因的表達(dá)，具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能〔2〕。本研究通過觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶能力、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的改變和海馬組織CREB 及其效應(yīng)蛋白CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)的DNA結(jié)合活性變化，探討腦缺血再灌注致血管性癡呆(VD)學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年SPF級(jí)SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001〕。CREB及C/EBP寡聚核苷酸探針(上海英俊生物工程有限公司)；核蛋白抽提試劑盒(美國(guó)Pierce公司)；EMSA試劑盒(德國(guó)Roche公司)；帶正電荷的尼龍膜(美國(guó)Pall公司)；戊巴比妥鈉(德國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模 用水迷宮將大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Nature Protocols推薦的標(biāo)準(zhǔn)〔3〕篩選出4只空間學(xué)習(xí)和記憶水平較差的大鼠后按體質(zhì)量差異隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷模型組，每組22只。模型組：戊巴比妥鈉(50 mg/kg)行腹腔麻醉后采用四血管阻斷(4-VO )方法〔4〕制備I/R大鼠模型。將大鼠行背側(cè)頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后將大鼠麻醉，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min，共3次，每次間隔1 h。假手術(shù)組：只做皮膚切口和組織分離處理，不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。各組飼養(yǎng)30 d。

1.2.2水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力 第25～30天，對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)。去除手術(shù)死亡者，各組大鼠20只為最終統(tǒng)計(jì)對(duì)象。以手術(shù)后第29天大鼠逃避潛伏期(將大鼠從入水點(diǎn)面向池壁置入水槽中，記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間)的平均成績(jī)作為學(xué)習(xí)成績(jī)；術(shù)后第30天大鼠空間探索次數(shù)(撤去平臺(tái)，將大鼠從第二象限入水點(diǎn)放入水槽，記錄60 s內(nèi)其經(jīng)過平臺(tái)象限的次數(shù))的平均成績(jī)作為記憶成績(jī)。逃避潛伏期越短、跨越臺(tái)次數(shù)越多，學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。

1.2.3HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài)改變 每組大鼠中隨機(jī)選取6只，1 g/L戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織。石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續(xù)切片HE 染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變。切片采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析：在10×40倍顯微鏡下，每張切片選6個(gè)不同子午線方向視野行各層細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.4電泳遷移率改變分析法(EMSA)測(cè)定CREB和C/EBP的DNA結(jié)合活性 將各組大鼠迅速斷頭處死，在低溫修塊臺(tái)上分離出雙側(cè)海馬組織。稱重剪碎，勻漿棄上清。按核蛋白提取試劑盒提供的操作規(guī)程提取核蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量后-80℃保存。設(shè)計(jì)CREB DNA結(jié)合序列 ：5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3′；C/EBP DNA結(jié)合序列5′-GATCAAGCTGCAGATTGCGCAAT -3′。探針標(biāo)記參照DIG Gel Shift Kit操作手冊(cè)進(jìn)行。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后調(diào)整探針濃度為15.5 pmol/L。取各樣本核蛋白4 μg與標(biāo)記的寡核苷酸探針2 μl 25℃孵育15 min。采用6%非變性聚丙烯酰凝膠4℃ 80V電泳分離DNA-核蛋白結(jié)合體。電泳完畢將DNA-核蛋白結(jié)合體轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)特異性條帶。經(jīng)曝光、顯影和定影后將圖像掃描至電腦，用Quantity one4.4凝膠分析軟件對(duì)特異結(jié)合條帶凈灰度值進(jìn)行采集。凈灰度值代表轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA的結(jié)合強(qiáng)度和活性。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)〔(41.3±1.8) vs (23.41±1.1)s,P<0.05〕，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少〔(5.3±0.6)vs(8.0±1.0)次，P<0.05〕。

2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目的改變 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失，胞核區(qū)域濃染，出現(xiàn)凝固性壞死及細(xì)胞脫失，正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目(16.33±1.08)較假手術(shù)組明顯減少(48.56±3.23，P<0.05)。見圖1。

2.3各組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性變化 經(jīng)EMSA檢測(cè),各組大鼠海馬組織核提取物均有與預(yù)先設(shè)計(jì)的CREB DNA序列的結(jié)合：與假手術(shù)組比較(612.50±43.56)，模型組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性顯著降低(142.25±27.86，P<0.01)。見圖2。

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(HE，×400)

圖2 大鼠海馬CREB的DNA結(jié)合活性比較

2.4各組大鼠海馬組織C/EBP DNA結(jié)合活性的影響 經(jīng)EMSA檢測(cè)，各組大鼠海馬組織核提取物均有與預(yù)先設(shè)計(jì)的C/EBP DNA序列的結(jié)合：與假手術(shù)組(1 218±37.15)比較，模型組大鼠海馬組織C/EBP的DNA結(jié)合活性顯著降低(97.00±5.88，P<0.01)。見圖3。

圖3 大鼠海馬C/EBP的DNA結(jié)合活性比較

3 討 論

VD的病理生理學(xué)機(jī)制包含多個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如免疫炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)等，這些環(huán)節(jié)互為因果形成惡性循環(huán)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死〔5〕，其功能表現(xiàn)之一為認(rèn)知功能下降。核轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化后可結(jié)合于基因啟動(dòng)子上游cAMP反應(yīng)單元(cAMP response element,CRE)的DNA結(jié)合序列，提高下游基因如即早基因(IEGs)c-fos、c-jun、c/reb等的表達(dá)。目前CREB已被確定為影響記憶存儲(chǔ)的關(guān)鍵蛋白〔6〕，可調(diào)節(jié)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和突觸可塑性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙可能與海馬區(qū)CREB -DNA結(jié)合活性下降相關(guān)。此外，CREB對(duì)腦缺血再灌注損傷可發(fā)揮保護(hù)作用。例如鹽酸美金剛(NMDA受體的拮抗劑)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子均可以通過不同途徑活化CREB從而減少缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡〔7，8〕。CREB可增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BNDF等的表達(dá),參與缺血損傷后神經(jīng)元的再生、存活及修復(fù)過程〔9，10〕。模型組神經(jīng)元損傷可能與谷氨酸NMDA受體興奮毒性、鈣超載引起的神經(jīng)毒性減少了CREB與DNA結(jié)合相關(guān)〔11，12〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組學(xué)習(xí)記憶功能下降的同時(shí)還出現(xiàn)了C/EBP-DNA結(jié)合活性的下降。C/EBP是IEGs的產(chǎn)物，它進(jìn)一步激活晚期反應(yīng)基因的表達(dá)，編碼長(zhǎng)期調(diào)節(jié)突觸功能所必需的蛋白質(zhì)。C/EBPβ在新記憶的永久化過程中具有促進(jìn)作用〔13〕。關(guān)于c/EBPs在腦缺血再灌注損傷中的作用還有待進(jìn)一步探討。有研究表明，C/EBPβ可介導(dǎo)缺血后的大腦免疫反應(yīng)和神經(jīng)元損傷〔14〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志，C/EBP同源蛋白(CHOP)在大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質(zhì)和海馬中均可誘導(dǎo)表達(dá)，在缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮重要作用〔15，16〕。在慢性腦低灌注狀態(tài)下，C/EBP-DNA結(jié)合活性與大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷30 d后，模型組大鼠海馬C/EBP活性相對(duì)于假手術(shù)組下降，機(jī)制可能為CREB-DNA結(jié)合活性的下降影

響了C/EBP的表達(dá)，從而降低了后者的活性。但其靶基因?yàn)楹?，是否和短暫的腦缺血再灌注中發(fā)揮的作用相似，c/EBPs家族成員的功能是否一致，尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)C/EBP-DNA結(jié)合活性與神經(jīng)元損傷變化趨勢(shì)相反，可能是缺血再灌注的早期反應(yīng)基因調(diào)節(jié)參與了神經(jīng)細(xì)胞的存亡，晚期調(diào)節(jié)反應(yīng)基因與組織修復(fù)和功能恢復(fù)有關(guān)。

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