人參單體皂苷Rh2與順鉑聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)小鼠前列腺癌凋亡

何靜春 李 峰 趙麗娟

(天津市第四中心醫(yī)院呼吸科一病區(qū)，天津 300141)

前列腺癌是在世界第六大常見癌癥，同時在北美和非洲一些地區(qū)前列腺癌是男性中最常見的癌癥。不同的地理區(qū)域有不同的發(fā)病率和死亡率〔1〕，吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心率先在中國開展了前列腺癌集團(tuán)篩查、預(yù)防和早期診治研究。通過2.3萬余人的前列腺特異性抗原(PSA)檢測結(jié)果顯示：近幾年長春市前列腺癌的發(fā)病率正呈逐漸上升趨勢〔2〕。目前對前列腺癌的治療手段之一為內(nèi)分泌療法，但多數(shù)患者經(jīng)治療一段時間后，其癌細(xì)胞大多由雄激素依賴性變?yōu)樾奂に胤且蕾囆?，而?dǎo)致腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移，結(jié)果使腫瘤細(xì)胞的生長無法控制而導(dǎo)致內(nèi)分泌治療失敗。本研究擬探討Rh2單獨用藥及Rh2與順鉑聯(lián)合應(yīng)用抗前列腺癌的作用，并揭示其作用機制，以期為臨床前列腺癌的預(yù)防和應(yīng)用安全有效的抗癌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57BL-6J小鼠購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。

1.2試劑 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) RNA提取試劑盒(Trizol),逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)，脫氧核糖核酸酶(DNase RO.1),TaqDNA,聚合酶，dNTP和DNA Ladder Marker均購于 Promega公司。免疫組化SABC 染色試劑盒及caspase-3抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。caspase-3引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。人參單體皂苷Rh2由吉林大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供。順鉑(CDDP)購于齊魯制藥廠。

1.3方法

1.3.1實驗分組 C57BL-6J雄性小鼠 40只，體重22±2 g，共分5組，每組8只。2×106個RM-1細(xì)胞(總體積0.2 ml)，接種于小鼠左季肋部，接種第三日開始給藥。①Rh2組：10 mg/kg，灌胃。②CDDP小劑量組：1 mg/kg，腹腔注射。③CDDP大劑量組：2 mg/kg，腹腔注射。④Rh2+CDDP小劑量組：Rh210 mg/kg灌胃，CDDP1 mg/kg，腹腔注射。⑤模型對照組。1次/d，連續(xù)給藥15 d。停藥次日，脫頸處死小鼠，剝離瘤塊，稱取瘤重，計算抑瘤率。

1.3.2RT-PCR檢測前列腺癌組織caspase-3 mRNA的表達(dá) 引物采用分子生物學(xué)分析軟件Primer 設(shè)計，caspase-3的引物序列:上游5′-ACTGGAATGTCATCTCGCTCTG -3′,下游5′-CCA CGACCCGTCCTTTGA-3′,擴增片段長度為468 bp;β-actin的引物序列:上游5′-TTGTTACCAACTGGGACG-3′,下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′,擴增片段長度為600 bp。

1.3.3RNA提取 將小鼠斷髓處死，迅速分離腫瘤，按Trizol液的說明書提取前列腺癌組織。參照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，總反應(yīng)體系20 μl，42℃反應(yīng)1 h，70℃反應(yīng)10 min，4℃反應(yīng)5 min，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，產(chǎn)物-20℃保存。取PCR產(chǎn)物4 μl經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察、拍照并用光密度儀掃描分析,β-actin吸光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計算caspase-3 mRNA表達(dá)的相對值。

2 結(jié) 果

2.1Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠的抑瘤率的影響 前列腺癌小鼠模型建立14 d后，模型組所有的小鼠腫瘤生長迅速，小鼠行動受限；Rh2給藥組小鼠腫瘤生長較慢，小鼠行動較自由，未見明顯異常體征，說明藥物未出現(xiàn)明顯毒副作用。統(tǒng)計分析表明，Rh2組、CDDP大劑量組、CDDP小劑量組，Rh2+CDDP小劑量組的腫瘤重量顯著低于模型組，給藥各組抑瘤率均大于30%(見表1)。Rh2+CDDP小劑量組瘤重明顯低于單獨CDDP小劑量組，說明Rh2與CDDP聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同的抑瘤作用。

2.2Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠的體重的影響 見表1，CDDP小劑量組、CDDP大劑量組，Rh2+CDDP小劑量組小鼠體重明顯下降，與模型組比較差異顯著(P<0.01)。Rh2組小鼠體重與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3Rh2、CDDP對前列腺癌組織內(nèi)caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 瓊脂糖凝膠電泳可見 caspase-3和β-actin兩條帶分別為435 bp和600 bp。前列腺癌組織中caspase-3 mRNA表達(dá)檢測表明：給藥各組caspase-3 mRNA的含量與內(nèi)參基因β-actin mRNA含量比值(0.91，1.34，1.37，1.02)明顯高于模型組(0.56)。見圖1。

2.4Rh2、CDDP對前列腺癌組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響 典型caspase-3基因表達(dá)陽性細(xì)胞，均為細(xì)胞質(zhì)著色，呈黃褐或黃色，不均勻散在分布，治療組的caspase-3基因表達(dá)情況明顯高于模型組。bcl-2基因的陰性表達(dá)細(xì)胞質(zhì)呈黃褐色，治療組前列腺癌組織胞質(zhì)著色細(xì)胞表達(dá)減少。見圖2。

表1 Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠體重、瘤重的影響

M：Marker,1～5:模型組，CDDP小劑量組，CDDP大劑量組，Rh2+CDPP小劑量，Rh2組

圖2 Rh2、CDDP對前列腺癌組織caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞增殖與凋亡失敗決定著腫瘤增長的速度，其中比較重要的因素就是細(xì)胞周期的調(diào)控細(xì)胞被阻止在G1/S期。在臨床腫瘤聯(lián)合化療中順鉑用藥頻度較大〔3〕，為了盡可能降低其毒副作用，國內(nèi)外一直在探索順鉑的安全用藥模式，但未取得顯著進(jìn)展〔4〕。目前已發(fā)現(xiàn)人參單體皂苷Rh2對體外人肝癌細(xì)胞SK-HEP-1的生長具有抑制作用，且對前列腺癌PC-3M細(xì)胞也有明顯的抗腫瘤效應(yīng)〔5〕。caspase家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，其中caspase-3被證實處于該級聯(lián)反應(yīng)的下游，為凋亡執(zhí)行基因，在凋亡過程中起著重要作用〔6〕。

本研究說明Rh2與小劑量CDDP聯(lián)合無增加其毒副作用，明顯低于大劑量CDDP組的毒副作用。Rh2具有與化療藥物CDDP相同的抑制腫瘤生長作用。其中Rh2與小劑量CDDP聯(lián)合應(yīng)用，抑瘤作用明顯高于單純小劑量CDDP的作用效果，其腫瘤抑制率與大劑量CDDP相近，說明Rh2可以在體內(nèi)協(xié)同CDDP的抗腫瘤作用。Rh2與CDDP能協(xié)同進(jìn)一步促進(jìn)caspase-3蛋白表達(dá)。

總之，Rh2聯(lián)合小劑量CDDP組能減少單獨大劑量CDDP抗小鼠前列腺癌帶來的毒副作用，卻能夠協(xié)同顯著提高抗小鼠前列腺癌細(xì)胞的效果。

4 參考文獻(xiàn)

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3Chi-Chih Cheng，Shu-Mei Yang.Molecular mechanisms of ginsenoside Rh2- mediated G1growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2005;55(6):531-40.

4Kobayashi M，Wood PA，Hrushesky WJ.Circadian chemotherapy for gynecological and genitourinary cancers〔J〕.Chronobiol Int，2002；19(1)：237-40.

5周桂華，孟 艷.人參單體皂苷Rh2對體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M抑制效應(yīng)的研究〔J〕.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001；6(27)：595-7.

6Denault JB，Eckelman BP，Shin H，etal.Caspase 3 attenuates XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)-mediated inhibition of caspase 9〔J〕. Biochem J，2007；405(1)：11-9.