缺氧卵巢癌細(xì)胞分化過程中LSD1表達(dá)的改變

薛端陽 張 潔 汪曉鶯 馬 艷 魏煒煒

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226019)

血管擬態(tài)(VM)是指具有高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞可以通過自身的伸展、變形形成血管樣細(xì)胞，這種腫瘤的特點就是具有高度可塑性。VM已在多種類型的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，而往往VM的發(fā)生都與不良的預(yù)后相關(guān)，可能受相關(guān)修飾酶的表遺傳調(diào)控。LSD1是一種重要的表遺傳調(diào)控酶類，具有組蛋白H3第4位賴氨酸二位去甲基化酶活性〔H3K4(2m)〕和組蛋白H3第9位賴氨酸去甲基化(H3K9)酶活性，從結(jié)構(gòu)上來看，LSD1的C端2/3區(qū)域與FAD依賴性胺氧化酶有高度的序列同源性，其N端含一個SWIRM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白相互作用基序。SWIRM結(jié)構(gòu)域使得LSD1及其家族與傳統(tǒng)的胺氧化酶有所不同，在生物發(fā)育中扮演著重要的角色。目前LSD1在腫瘤發(fā)生中的研究主要集中在對細(xì)胞增殖生長的影響，尚未見到LSD1對于相關(guān)腫瘤細(xì)胞形成VM能力的報道。本文初步探討LSD1分子在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移上的作用。

1 材料與方法

1.1試劑及主要儀器 RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Trypsin) 、胎牛血清(FBS) 購自北京鼎國生物有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO) 為天津化學(xué)試劑二廠產(chǎn)品；余為國產(chǎn)分析醇。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO 公司產(chǎn)品。An Thos TH2酶標(biāo)儀為Austria公司生產(chǎn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和MTT 缺氧和對照組的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48小時換液1次，0.25% 的胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞單層貼壁生長，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。將SKOV3細(xì)胞株分為對照組、缺氧組。對照組為未處理的SKOV3細(xì)胞株。采用MTT法測定72 h的細(xì)胞增殖的抑制效率，用0.25%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞株SKOV3，制成4×104/ml細(xì)胞懸液，以每孔200 μl接種于兩個96孔板。采用全自動酶標(biāo)儀測定每孔的492 nm吸光度OD值。計算細(xì)胞存活率和抑制率。

1.3細(xì)胞缺氧誘導(dǎo) 將接種的細(xì)胞置于GENbox Jar2.5L厭氧盒中，持續(xù)充以混合氣體(5%CO2+1%O2+94%N2)，壓力為0.1 mPa，氣體從容器的另一孔排出，模擬1%CO2的缺氧環(huán)境。

1.4Matrigel膠三維培養(yǎng) 將Matrigel與RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含OVCAR-3細(xì)胞數(shù)約1×104)按1∶3混合，滴入24孔培養(yǎng)板，每孔150 μl，37℃孵育30 min凝膠，建立Matrigel膠三維培養(yǎng)系統(tǒng)，將對數(shù)生長期OVCAR-3(每孔1×105個)單細(xì)胞懸液接種于Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)，分別在常氧(常氧組)、缺氧(1%O2，缺氧組)等條件下培養(yǎng)。每隔48 h換液，培養(yǎng)7 d，相差顯微鏡動態(tài)觀察擬態(tài)血管形成情況并攝片。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞中LSD1表達(dá)和H3K4(2m)去甲基化酶活性 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞裂解液500 μl， 輔以細(xì)胞刮刀于冰上裂解細(xì)胞，0℃離心5 000 r/min×10 min，取上清，-80 ℃凍存。SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡檢測蛋白質(zhì)，一抗山羊抗人(LSD1，山羊抗人H3K4(2m)1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，將轉(zhuǎn)印膜放入用10%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP耦聯(lián)的二抗(1∶750)中，洗膜、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1缺氧條件下Matrigel三維培養(yǎng)OVCAR-3細(xì)胞形成VM 利用Matrigel膠三維培養(yǎng)觀察VM的形成情況。常氧條件下， OVCAR-3細(xì)胞雖能出現(xiàn)長條形伸展或細(xì)胞質(zhì)有多個突起，部分表現(xiàn)出條索狀和不規(guī)則橢圓形等改變，但不能形成上述管道樣結(jié)構(gòu)。缺氧條件培養(yǎng)下， OVCAR-3細(xì)胞浸潤在Matrigel上疊加生長，隨著缺氧時間的延長，部分細(xì)胞逐漸伸展、變形，呈長條形或弧形，7 d后細(xì)胞與細(xì)胞之間開始相互連接，并能形成腔樣、管狀、分支和網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)等脈管樣改變。見圖1。

圖1 缺氧對Matrigel三維培養(yǎng)6 d OVCAR-3細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

2.2缺氧條件下OVCAR-3細(xì)胞LSD1的表達(dá)及酶活性檢測 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細(xì)胞，用Western印跡檢測LSD1及H3K4的水平(圖2)。缺氧條件刺激下，LSD1的表達(dá)有明顯的升高(2.91±0.2)(P=0.000)。為了說明LSD1的主要酶活性的升高，同時檢測H3K4(2m)的水平，實驗證明H3K4的相對水平隨著LSD1升高而降低(0.22±0.03)(P=0.017)，兩組間有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 缺氧對OVCAR-3細(xì)胞LSD1表達(dá)和H3K4(2)水平的影響

2.3缺氧條件下OVCAR-3細(xì)胞的生長狀態(tài) 倒置顯微鏡下，對照組和缺氧組的SOVAR-3 細(xì)胞均呈現(xiàn)，貼壁良好、形態(tài)梭形、胞核橢圓、胞漿透亮的狀態(tài)(圖3)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，MTT 法測定SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用，計算細(xì)胞抑制率，對照組和缺氧組分別是(1.32±0.01)，(1.34±0.01)(P=0.062)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 缺氧對培養(yǎng)4 d OVCAR-3細(xì)胞角形態(tài)影響(×400)

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞從原發(fā)性部位轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位形成腫瘤的過程，它是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和影響預(yù)后的重要因素。多數(shù)癌癥都有侵襲轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。而浸潤轉(zhuǎn)移是也是晚期食管癌重要死因。1999年，VM在在具有高度侵襲型的葡萄膜黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)〔1〕。VM獨特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)類似與胚胎的血管網(wǎng)絡(luò)。而兩者結(jié)構(gòu)的相似性被認(rèn)為是具有高度浸潤性的腫瘤細(xì)胞具有類似與胚胎樣表型的分化潛能?；虮磉_(dá)研究揭示具有分化為VM的能力的高度侵襲性的黑色素瘤的基因表達(dá)與包括上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞特性在內(nèi)的多細(xì)胞表型有關(guān)〔2，3〕。

VM形成的“原動力”腫瘤細(xì)胞的缺氧狀態(tài)。在缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它在血管形成、細(xì)胞增殖、能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞黏附等相關(guān)基因的調(diào)控方面均占很重要的地位。在某些腫瘤(卵巢癌、宮頸癌等婦科實體瘤)發(fā)生過程中，缺氧是微環(huán)境的基本特征之一，作為一種應(yīng)激原可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)一系列基因?qū)Φ脱鯛顟B(tài)做出應(yīng)答反應(yīng)，并通過多條途徑使缺氧相關(guān)因子的表達(dá)增多。有研究顯示VM可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、EphA2等血管生成基因表達(dá)上調(diào)〔4，5〕。這些分子及其配體對血管的生成和維持極其重要〔6〕。VM形成后可以使腫瘤細(xì)胞獲得供氧，最終導(dǎo)致血液循環(huán)〔1，7〕。

參與可塑性腫瘤細(xì)胞形成VM的各種分子，而并不依賴某一條分子信號通路，這可以解釋為什么不同的腫瘤細(xì)胞在形成擬態(tài)血管時表達(dá)不同的VM相關(guān)基因，一些基因的“開或關(guān)”受表遺傳修飾控制。自從Strahl 和Allis提出“組蛋白密碼”假說后，組蛋白修飾逐漸成為表遺傳領(lǐng)域研究的熱點。2004年，第一個組蛋白賴氨酸去甲基化酶LSD1被發(fā)現(xiàn)〔8〕。LSD1發(fā)揮著重要的生理功能并與很多疾病有密切的關(guān)系〔9，10〕。在很多腫瘤細(xì)胞增殖生長過程中，LSD1表現(xiàn)出“原癌基因”的特性。令人感興趣的是：本實驗發(fā)現(xiàn)LSD1分子在缺氧條件下表達(dá)上升，SKOV-3細(xì)胞的增殖能力缺未受影響。這也提示LSD1分子并不促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。

Wang等〔11〕的研究曾發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，研究LSD1可以形成NuRD復(fù)合物的一個亞單位，控制乳腺癌細(xì)胞遷移能力。在此過程中，LSD1行使H3K4(2m)去甲基化酶活性，啟動了下游基因的開啟。但是目前尚未見LSD1對于相關(guān)腫瘤形成VM能力的報道。本實驗說明缺氧促進(jìn)擬態(tài)血管的形成的同時也伴隨著LSD1的表達(dá)上升和H3K4(2m)去甲基化酶活性的提高。結(jié)果提示LSD1參與卵巢癌細(xì)胞VM的形成。不過，缺氧條件下卵巢癌細(xì)胞LSD1對于VM形成的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

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