絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞胰島素蛋白表達(dá)的作用

李 健 劉東慧 宋成軍 陳志宏

(承德市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

2型糖尿病(T2DM)致殘率、致死率較高，并且超過(guò)85%〔1〕。T2DM主要以血糖升高、胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞功能受損等為主要特征〔2，3〕。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)制T2DM大鼠模型，觀察絲膠對(duì)模型大鼠胰島β細(xì)胞胰島素蛋白表達(dá)的作用，探討絲膠保護(hù)糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組處理 36只3月齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g(合格證號(hào)：712024)，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg)3 d，7 d后檢測(cè)空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作為T(mén)2動(dòng)物模型成功的標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組和絲膠治療組(n=12)，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d；正常對(duì)照組、模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃35 d。

1.2藥物與試劑 STZ(美國(guó)Sigma公司)臨用前用pH4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制成2%的溶液；血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司；兔抗胰島素多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。絲膠，彩色蠶繭(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供)經(jīng)浸泡、水煎、過(guò)濾、濃縮而成。

1.3檢測(cè)血糖 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心20 min后分離血清，-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4檢測(cè)胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá) 大鼠取血后斷頭處死，取胰腺Bouins液固定后常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5 μm。免疫組化SP法觀察胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)：一抗稀釋濃度為1∶400，4℃孵育過(guò)夜；二抗(工作液)37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為胰島素蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)。胰島素蛋白免疫陽(yáng)性結(jié)果定量分析：采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在顯微鏡下(10×40倍)隨機(jī)選取胰島作為觀察視野，計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物面積占胰島面積的比值。每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個(gè)胰島，取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠的血糖 絲膠治療組大鼠的血糖均明顯低于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的血糖和胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)

2.2各組大鼠胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá) 胰島素蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒狀，位于胰島β細(xì)胞胞質(zhì)見(jiàn)圖1。胰島素蛋白定量分析結(jié)果見(jiàn)表1：與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；絲膠治療組大鼠胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)(免疫組化染色，×400)

3 討 論

STZ致糖尿病的機(jī)制是其能夠直接特異性殺傷胰島β細(xì)胞，并且小劑量多次注射STZ可導(dǎo)致T2DM〔5，6〕。STZ具有活潑的羥基結(jié)構(gòu)，可直接損傷胰島β細(xì)胞的DNA，并刺激β細(xì)胞釋放過(guò)氧化氫，過(guò)量的過(guò)氧化氫及其轉(zhuǎn)化生成的羥自由基還可通過(guò)增加脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平抑制胰島素釋放。STZ還有亞硝基基團(tuán)，可產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮通過(guò)參與多種自由基級(jí)聯(lián)式反應(yīng)，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡；同時(shí)，一氧化氮還能抑制胰島β細(xì)胞線粒體的功能，降低胰島素的分泌〔7〕。

胰島素是胰島β細(xì)胞分泌的機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，主要作用是促進(jìn)物質(zhì)合成，因此又被稱為“儲(chǔ)存激素”，在調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝方面具有重要作用〔8〕。糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞破壞或功能減退，胰島素分泌不足或缺乏，糖進(jìn)入組織細(xì)胞貯存及在細(xì)胞內(nèi)氧化利用發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致血糖升高及一系列相關(guān)的病理生理變化〔9〕。另外，糖尿病時(shí)胰島素分泌不足，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解增加、合成受限，體內(nèi)蛋白質(zhì)出現(xiàn)負(fù)平衡〔10〕；同時(shí)，由蛋白質(zhì)分解釋放到血漿中的戊糖氨基酸如丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸等水平升高，被肝臟攝取轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)一步導(dǎo)致血糖的升高〔11〕。

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬“消渴癥”，以生精清熱、潤(rùn)燥養(yǎng)陰等為治療原則。蠶繭為蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無(wú)毒，可滋陰潤(rùn)燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本文前期研究亦發(fā)現(xiàn)，絲膠(彩色蠶繭水提取物)可明顯降低血糖和調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，保護(hù)糖尿病時(shí)生殖功能障礙〔12～14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可通過(guò)提高胰島β細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)，恢復(fù)胰島β細(xì)胞的功能并增加胰島β細(xì)胞分泌胰島素，從而有效降低血糖，并改善糖尿病時(shí)3大物質(zhì)代謝紊亂，有效緩解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的毒副作用，因此可能具有良好的推廣應(yīng)用前景，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

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