ETV4在乳腺癌中的表達及其與血管生成的關系

薛成軍 文娟娟 劉 藝 陳治水 袁 蓉 王勇軍 崔麗娟 陳 輝

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016)

ETS變異體(ETV)4作為ETS家族多瘤病毒增強子激活劑(PEA)3亞家族的一員，具有復雜的結構和功能，它的過表達可導致細胞的惡性轉化，增強腫瘤細胞的侵襲性和轉移性。Firlej等〔1〕在動物實驗中證實抑制ETV4的表達可以減慢乳腺癌細胞株的增殖和轉移；反之，上調其表達則對乳腺組織產生致瘤作用。已有研究證實脯氨酸羥化酶(PHD)2在黑色素瘤的血管生成中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用〔2〕。Wollenick等〔3〕利用核酸分子雜交和熒光共振能量轉化分析技術，首次發(fā)現(xiàn)ETV4可以激活PHD2。本文探討ETV4在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及病理分型等方面的作用。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集我院2011年10月至2012年5月資料完整的女性乳腺癌手術組織標本97例，年齡28～83〔平均(52.9±12.8)〕歲。并隨機取離腫塊5～7 cm的正常組織10例作為陰性對照。組織學類型：浸潤性導管癌87例，其他10例(包括導管內癌3例，浸潤性小葉癌3例，乳頭狀腺癌4例)。按國際抗癌聯(lián)盟2010年標準進行TNM分期：Ⅰ期37例，Ⅱ期36例，Ⅲ期24例，Ⅳ期0例。病理學分級：Ⅰ級24例，Ⅱ級31例，Ⅲ級42例。所有標本均經病理確診，且手術前均未接受過化療和放療等針對性治療。

1.2試劑 鼠抗人ETV4單克隆抗體(濃縮液)購自英國Abcam公司(貨號：ab70425)。CD34、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、Ki-67和HER2/neu的鼠抗人單克隆抗體(即用型)均購自中杉金橋公司。

1.3方法 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)染色三步法進行免疫組織化學染色。制片：組織標本以10%甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，貼附于經APES處理的載玻片，60℃烤片2 h。染色：①常規(guī)脫蠟脫水；②滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉10 min)，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；③pH6.0檸檬酸緩沖液高溫高壓行抗原修復，PBS沖洗，5 min×3次；④5%山羊血清封閉，室溫孵育5 min，傾去血清，PBS沖洗，5 min×3次；分別滴加ETV4(1∶200稀釋)，CD34、ER、PR、Ki-67和HER2/neu一抗工作液，4℃冰箱過夜，PBS沖洗，5 min×3次；⑤滴加IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3次；⑥DAB顯色；⑦自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹脂封片。

1.4結果判定標準 光鏡下每張切片中選取癌細胞較多的5個高倍視野，每個視野計數100個細胞。染色強度分級如下：無著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3；陽性細胞數分級為：陽性細胞數<10%為0，10%～25%為1，25%～50%為2，>50%為3，兩項得分相乘結果≥3為陽性表達病例。ER、PR、Ki-67、HER2/neu陽性標準參照試劑操作說明判定。微血管密度(MVD)計數方法：用CD34標記血管內皮細胞，參照Weidner計數法〔4〕，由兩位不知道臨床資料的病理醫(yī)師在低倍鏡(×10)下找到3個血管最密集區(qū)域，再在高倍鏡(×40)視野下計數微血管數目。凡單個孤立的或多個緊密排列的內皮細胞團，只要與鄰近腫瘤細胞及周圍結締組織成分分界清楚，不論有無血管腔，即可計數為1 個微血管數，但應忽略管腔直徑>8個紅細胞或管壁有平滑肌存在的血管。取3個視野的微血管數的平均值作為該標本的MVD。兩位病理醫(yī)師計數差異10%以上者需重新計數。

2 結 果

2.1乳腺癌組織中ETV4的表達與乳腺癌患者臨床特征之間的關系 43.3%的乳腺癌組織中ETV4呈陽性表達。顯微鏡下，乳腺癌細胞的胞核和(或)少部分胞質中，ETV4呈陽性表達；癌旁細胞則呈陰性表達。見圖1。ETV4的陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、病理學分級和TNM分期存在正相關(r=0.249，P<0.05，r=0.263，P<0.05；r=0.316，P<0.01；r=0.255，P<0.05)；但與患者的年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

2.2乳腺癌組織ETV4的表達與微血管密度之間的關系 顯微鏡下，CD34主要表達于乳腺癌組織的血管內皮細胞。見圖2。ETV4(+)乳腺癌組織的MVD高于ETV4(-)乳腺癌組織的MVD(47.6±15.7 vs 34.6±10.9，P<0.01)。經Spearman相關分析，ETV4的表達與MVD呈顯著性正相關(r=0.247，P<0.01)。

2.3ETV4與現(xiàn)有乳腺癌病理指標的相關性分析 經Spearman相關分析，在乳腺癌中，ETV4的表達與HER2/neu的表達和Ki-67的增殖指數呈正相關(r=0.241，P<0.05；r=0.253，P<0.05)，但與ER和PR的表達無相關性(P>0.05)。見表2。

圖1 ETV4在乳腺癌細胞中的陽性表達(SP，×200)

表1 乳腺癌組織中ETV4表達與乳腺癌患者臨床特征間的關系〔n(%)〕

圖2 CD34在不同乳腺癌組織中的表達情況(SP，×100)

表2 乳腺癌組織ETV4表達與ER、PR、HER2/neu、Ki-67之間的相關性分析〔n(%)〕

3 討 論

ETS最早是由美國Frederick國家癌癥研究所分子腫瘤學實驗室在鳥骨髓成紅細胞增多癥病毒E26的基因序列中發(fā)現(xiàn)的。ETV4作為ETS家族PEA3亞家族中的一員，也曾被稱為腺病毒E1A增強子結合蛋白。通過對ETV4轉錄因子mRNA水平的分析，發(fā)現(xiàn)它在人類胚胎期和成年期的多種器官的正常組織中都有低水平的表達。在乳腺正常組織和癌組織的對比研究中，通過檢測ETV4的mRNA水平發(fā)現(xiàn)兩者之間有明顯差異，并認為ETV4在乳腺癌發(fā)生的基因調節(jié)過程中可能起到關鍵作用。Baker等〔5〕通過對MMTV/Wnt1轉基因鼠的研究中發(fā)現(xiàn)沉默ETV4基因可以延緩乳腺癌的發(fā)生時間和生長速度。本研究結果表明ETV4在乳腺癌發(fā)生，發(fā)展和轉移過程中都發(fā)揮著重要作用。Yuen等〔6〕在原發(fā)性乳腺癌細胞的研究中，進一步證實ETV4和乳腺癌的病理學分級和預后相關。

許多研究證實，惡性腫瘤的生長和轉移與血管生成密切相關。目前，在腫瘤血管生成方面的研究中，通過血管內皮細胞標記物測量腫瘤MVD是公認的能夠代表腫瘤血管生成狀態(tài)的方法。其中CD34是重復性較好的血管內皮細胞標記物〔7〕。來自腎臟形態(tài)發(fā)生方面的研究表明，ETV4能促進上皮細胞出芽并進一步形成脈管樣結構，并通過一個復雜的通路與周圍的組織間質產生相互作用〔8〕，提示ETV4在血管的形成中可能發(fā)揮重要作用。本研究結果提示ETV4與乳腺癌組織中的血管生成有密切關聯(lián)。相關的基礎研究均支持本研究結果，Wollenick等〔3〕應用免疫共沉淀的方法，發(fā)現(xiàn)ETV4可以與缺氧誘導因子-1α一起作用于PHD2的啟動子，刺激它的表達；而PHD2是在惡性腫瘤的血管生成中發(fā)揮關鍵作用的基因〔9〕。然而，Chen等〔10〕則證實ETV4的過表達可以增強白細胞介素(IL)-8的啟動子的活性，從而上調其表達，而IL-8屬于炎癥趨化因子，屬于缺氧誘導因子-1α的下游因子，在腫瘤血管生成和轉移中發(fā)揮重要作用。本研究雖然通過臨床標本觀察到了ETV4與乳腺癌微血管生成之間的關系，至于ETV4是通過何種通路發(fā)揮作用，本課題組將開展進一步研究。

HER2/neu屬于表皮生長因子受體家族，與乳腺癌的發(fā)生，轉移和藥物抵抗相關聯(lián)，并在人類20%～30%的乳腺癌中存在拷貝數增加和過表達〔11〕。在轉基因鼠的研究中，已證實ETV4是HER2/neu表達過程中不可或缺的一部分，并提示它可能是HER2/neu蛋白的下游效應因子。本研究顯示，乳腺癌組織中ETV4過表達與HER2/neu的過表達存在正相關，與斯向東等的報道一致〔12〕。但是，Xia等〔13〕在2006年的報道認為ETV4在乳腺癌中的表達與HER2/neu無相關性。這一矛盾不排除與方法學的進步有關，因為近年來在分子水平的研究提示HER2/neu和ETV4之間可能存在一個惡性循環(huán)，HER2/neu可以激活ETV4轉錄因子的活性，而ETV4轉錄因子反過來可以通過結合HER2/neu基因的啟動子而激活它轉錄。

Ki-67抗原為細胞核內分裂增殖相關蛋白，在細胞周期S、G1、G2、M期均有表達，G0期缺如，常作為腫瘤細胞增殖活性的可靠標記。Ki-67的表達能敏感地反應惡性腫瘤的增殖情況，與多種惡性腫瘤的發(fā)展，轉移和與預后有關〔14〕。本研究在國內首次報道ETV4的表達與Ki-67增值率呈顯著性正相關，推測：ETV4和Ki-67可能擁有共同信號通路，并作為分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的下游基因在乳腺癌的增殖過程中共同發(fā)揮作用。因為ETV4被激活較公認的通路是：HER2/neu-RAS-RAF-MEK-MAPK-PEA3〔15〕，即MAPK激活包括ETV4在內的所有PEA3轉錄因子亞家族成員。黃坊等〔16〕在鼻咽癌細胞增殖凋亡的研究中也發(fā)現(xiàn)，Ki-67與MAPK成明顯正相關，并認為Ki-67可能是MAPK的下游基因。

由于ETV4在乳腺癌組織中高表達，并與乳腺癌組織的血管生成和乳腺癌患者的臨床特征高度相關，本研究認為，深入研究ETV4與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是與血管生成的分子機制，將為乳腺癌的基因治療、化療新藥的設計和實驗室生物標志等方面開辟新的思路。

4 參考文獻

1Firlej V，Ladam F，Brysbaert G，etal.Reduced tumorigenesis in mouse mammary cancer cells following inhibition of Pea3-or Erm-dependent transcription〔J〕.Cell Sci，2008；121(20)：3393-402.

2Spinella F，Rosanò L，Del DM，etal.Endothelin-1 inhibits proly1 hydroxylase domain 2 to activate hypoxia-inducible factor-1 alpha in melanoma cells〔J〕.PLoS One，2010；5(6):e11241.

3Wollenick K，Hu J，Kristiansen G，etal.Synthetic transactivation screening reveals ETV4 as broad coactivator of hypoxia-inducible factor signaling〔J〕.Nucleic Acids Res，2012；40(5)：1928-43.

4Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pzza F，etal.Tumor angiogensis：a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma〔J〕.J Natl Cancer Inst,1992；84(24):1875-87.

5Baker R，Kent CV，Silbermann RA，etal.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia〔J〕.PLoS One,2010；5(1):1765-73.

6Yuen HF，Chan YK，Grills C,etal.Polyomavirus enhancer activator 3 protein promotes breast cancer metastatic progression through snail-induced epithelial-mesenchymal transition〔J〕.J Pathol，2011；224(1):78-89.

7周歷安.乳腺癌彩色多普勒血流表現(xiàn)與術后組織中血管內皮生長因子和血管密度的關系〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(9):1831-2.

8Lu BC，Cebrian C，Chi X，etal.Etv4 and Etv5 are required downstream of GDNF and ret for kidney branching morphogenesis〔J〕.Nat Genet，2009；41(12):1295-302.

9Chan DA，Kawahara TL，Sutphin PD,etal.Tumor vasculature is regulated by PHD2-mediated angiogenesis and bone marrow-derived cell recruitment〔J〕.Cancer Cell，2009；15(6):527-38.

10Chen Y，Chen L，Li JY，etal.ERβ and PEA3 co-activate IL-8 expression and promote the invasion of breast cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther，2011；11(5):497-511.

11Hojati Z，Orangi E.HER2/neu gene amplification assessment in breast cancer patients in Isfahan province by real time PCR，differential PCR and immunohistochemistry〔J〕.Gene,2012；497(2):237-42.

12斯向東，唐劍敏，沈晶瑩，等.PEA3蛋白在乳腺癌組織中的表達及其與HER2/neu的關系〔J〕.中國癌癥雜志,2011；21(10):766-70.

13Xia WY，Lien HC，Wang SC，etal.Expression of PEA3 and lack of correlation between PEA3 and HER2 /neu expression in breast cancer〔J〕.Brest Cancer Res Treat,2006；98(3):295-301.

14Fracalossi AC，Comparini L，F(xiàn)unabashi K,etal.Ras gene mutation is not related to tumour invasion during rat tongue carcinogenesis induced by 4-nitroquinoline 1-oxide〔J〕.J Oral Pathol Med，2011；40(4):325-33.

15Guo B，Panagiotaki N，Warwood S，etal.Dynamic modification of the ETS transcription factor PEA3 by sumoylation and p300-mediated acetylation〔J〕.Nucleic Acids Res，2011；39(15)：6403-13.

16黃 坊,謝 明,景志亮,等.ERK/MAPK信號通路活性表達與鼻咽癌細胞增殖凋亡的關系〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2010；17(15):1192-5.