PKC-α蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平在妊娠期高血壓大鼠腎臟中的表達(dá)及意義

楊宏靜

(三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120)

妊娠高血壓(簡(jiǎn)稱妊高征)，是妊娠期婦女所特有而又常見的疾病，以高血壓、蛋白尿、水腫、抽搐、昏迷、心腎衰竭甚至發(fā)生母子死亡為臨床特點(diǎn)〔1〕。妊高征綜合征按嚴(yán)重程度分為輕度、中度和重度，重度妊娠高血壓綜合征又稱先兆子癇和子癇，即在高血壓基礎(chǔ)上有抽搐〔2〕。妊高征的生理病理改變非常廣泛，全身小動(dòng)脈的痙攣是基本病變，小動(dòng)脈痙攣可導(dǎo)致多器官系統(tǒng)(如心臟、腎臟、肝臟等)的病理性損害，其中腎功能損傷是妊高征的早期發(fā)病特征〔3，4〕。有研究認(rèn)為，蛋白激酶C(PKC)與妊高征疾病腎臟損害存在著相關(guān)關(guān)系，本研究通過檢測(cè)妊高征疾病大鼠腎臟中PKC-α蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而了解PKC-α蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平在妊高征疾病大鼠腎臟中的表達(dá)意義。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar大鼠48只(體重200～250 g， 14～16 w)。試劑：亞硝基左旋精氨酸甲酯、生理鹽水、乙醚、PKC鼠抗體(美國Santa Cruz公司)、堿性磷酸酶耦聯(lián)的山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)、顯色試劑盒、Trizol RNA抽提試劑(美國Promega公司)、RT-PCR一步法試劑盒(美國Promega公司)、TaqDNA聚合酶(上海生工公司)。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組 妊娠鼠模型的建立：將16只Wistar雌性大鼠和32只雄性大鼠以1∶2合籠，第2天早晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，若發(fā)現(xiàn)了精子，則動(dòng)物模型建立。

分組及處理：將妊娠鼠隨機(jī)均分為妊娠期高血壓疾病組(疾病組)和正常妊娠組，每組妊娠鼠8只；剩余的8只未交配健康孕齡雌鼠為未妊娠組。疾病組妊娠鼠于妊娠第13天(陰道分泌物確認(rèn)有精子時(shí)刻即為妊娠第1天)開始皮下注射亞硝基左旋精氨酸甲酯，注射250 mg/kg；正常妊娠組妊娠鼠則于妊娠第13天注入生理鹽水，注射250 mg/kg，1次/d。三組所有雌鼠均在妊娠第21天在乙醚麻醉下打開腹腔，取出腎臟，腎臟樣本置于液氮保存待用。

1.3Western印跡雜交〔5〕在取得的腎臟組織中加入5倍體積的緩沖液，在冰浴下用玻璃研磨器(15 000 r/min，30 min)粉碎，后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，靜置后取其上清液，所得即為胞漿蛋白。將所有的胞漿蛋白樣本置于十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠上電泳(5～6 h)，之后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。然后用1∶200的PKC鼠抗體進(jìn)行Western印跡，印跡后用1∶2 000二抗性堿性磷酸酶耦聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體處理，利用顯色試劑盒對(duì)各樣本圖像進(jìn)行檢測(cè)和攝影。

1.4RT-PCR半定量測(cè)定〔6〕鼠腎臟組織總RNA采用Trizol一步法進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行操作，擴(kuò)增PKC-α的PCR產(chǎn)物后，檢測(cè)其mRNA含量。PCR反應(yīng)各步驟的條件分別為：熱啟動(dòng)：94℃，3 min；擴(kuò)增、變性：94℃，30 s；退火：58℃，1 min；延伸：72℃，2 min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。PKC-α引物序列：正義：5′-TGA ATC GTG AGT GGA ATG AGT-3′，反義：5′-GGT TGC TTT GTC TCT TCT GAA-3′，擴(kuò)增片段長度293 bp；β-actin引物序列：正義：5′-GTG GGC CGG TGT AGG CAC CAT-3′，反義：5′-GGT TGG CCT TAG GGT TCA GGA-3′，擴(kuò)增片段500 bp。PCR產(chǎn)物置于12%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳后，通過UVP凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行掃描分析電泳條帶的灰度值，PKC-α mRNA表達(dá)的相對(duì)含量=mRNA條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，行一般統(tǒng)計(jì)描述、t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1三組腎組織樣本的PKC-α表達(dá)水平比較 三組腎組織樣本均有PKC-α表達(dá)，三組間的PKC-α表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；疾病組與未妊娠組腎組織樣本的PKC-α表達(dá)水平均高于正常妊娠組(均P<0.05)。見圖1。

2.2三組的腎組織樣本PKC-α的mRNA轉(zhuǎn)錄比較 三組的腎組織樣本的PKC-α 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中妊高征疾病組與未妊娠組的腎組織樣本PKC-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于正常妊娠組(P<0.05)。

圖1 PKC-α Western印跡結(jié)果

圖2 PKC-α RT-PCR結(jié)果

3 討 論

PKC屬于絲蘇氨酸蛋白激酶家族，激活的PKC可使多種蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而影響細(xì)胞內(nèi)生物信息的傳遞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分化、增殖乃至癌變中具有十分重要的作用；其次，PKC還是Ca2+磷脂依賴性蛋白激酶，廣泛存在于組織細(xì)胞中，在靜息狀態(tài)下，PKC主要以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界刺激時(shí)PKC從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮其活性作用；PKC可參與一系列與生命現(xiàn)象相關(guān)的過程，如：介導(dǎo)細(xì)胞增殖與分化、影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、參與代謝調(diào)節(jié)及控制細(xì)胞膜功能等；最后，PKC是細(xì)胞內(nèi)諸多信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)、信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)間相互影響的中心環(huán)節(jié)，而信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)可以通過細(xì)胞外刺激來調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮、舒張、增殖分化以及細(xì)胞內(nèi)有關(guān)物質(zhì)的合成等〔7～9〕。

PKC在腎臟中廣泛存在，在維持和調(diào)節(jié)腎臟的功能方面起重要作用。PKC介導(dǎo)妊高征疾病腎臟病變機(jī)制為：PKC可改變磷酸化激動(dòng)蛋白的功能和結(jié)構(gòu)，增大內(nèi)皮細(xì)胞間隙，降低細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)間的連接，從而增加腎臟細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致尿蛋白〔10〕；PKC在細(xì)胞內(nèi)被激活后，可催化多種蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增生和收縮功能起著重要的調(diào)節(jié)作用；再次，PKC可降低細(xì)胞內(nèi)的Na-K-ATP酶活性〔11〕；PKC-α為PKC的一個(gè)亞型，除具有PKC的以上功能外，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PKC-α可激活有絲分裂原活化的蛋白激酶途徑，進(jìn)而改變腎內(nèi)血流的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)白蛋白的通透性和增加轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的表達(dá)；另外，PKC-α活化后可磷酸化PKC內(nèi)源性底物，通過胞內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制誘導(dǎo)血管通透因子(VPF)的產(chǎn)生，從而引起蛋白尿〔12〕。

綜上，妊高征疾病大鼠腎臟中的PKC-α蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)較高，PKC-α蛋白可能是導(dǎo)致妊高征疾病腎臟損傷的因素之一。

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