苦參素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖和MicroRNA-122、MicroRNA-21表達(dá)的影響

黃贊松 向發(fā)良 周喜漢 黃衍強(qiáng) 鄧志華 仇儀英

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

肝癌的發(fā)生、發(fā)展與微小RNA(miRNA或MicroRNA)的異常表達(dá)有關(guān)，其中在肝癌中表達(dá)上調(diào)，行使癌基因的功能，被稱為“腫瘤miRNA”(OncomiRs)〔1，2〕，如MicroRNA-21作為一個(gè)原癌miRNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3〕；另一部分miRNA 則行使抑癌基因的功能。目前，肝癌的治療仍以綜合治療為主，但放、化療毒副作用大，中藥能降低化療藥物的毒副作用，增強(qiáng)人體免疫力，提高患者生存質(zhì)量和延長生命所體現(xiàn)的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腫瘤治療方法的不足〔4〕苦參素是苦豆子等中草藥活性成分的提取物，具有抗肝癌的作用〔5〕，但其抗肝癌的作用機(jī)制未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)研究不同濃度苦參素(Oxymatrine或OM)抗肝癌的作用，同時(shí)研究苦參素對(duì)HepG2細(xì)胞中MicroRNA-122、MicroRNA-21表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HepG2細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。并在含10%小牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的RPMI21640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(MCO-18AIC CO2)內(nèi)培養(yǎng)?？鄥⑺刈⑸湟?.6 mg/mL，購于湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。小牛血清購于GIBCO公司(北美洲)，RPMI21640培養(yǎng)液及胰酶均購于北京索萊寶科技有限公司。MTT配制成5 mg/ml，過濾除菌分裝備用。miRcute miRNA 提取試劑盒(目錄號(hào)：DP501)、miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(目錄號(hào)：KR201)、miRcute miRNA熒光定量試劑盒(目錄號(hào)：FP401)均購于天跟生化科技(北京)有限公司。MicroRNA-122、MicroRNA-21、U6(目的序列與內(nèi)參序列具有相同的擴(kuò)增效率)引物均購于天跟生化科技(北京)有限公司。儀器BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜，MCO-18AIC CO2恒溫培養(yǎng)箱，全自動(dòng)酶標(biāo)儀Multiskan MK3，倒置顯微鏡，臺(tái)式高速冰凍離心機(jī)1-15PK，微型離心機(jī)UniForce6K，RT-PCR儀IQ5，凝膠成像儀。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測不同濃度苦參素作用HepG2細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以5×104/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液，分為實(shí)驗(yàn)組苦參素組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組加細(xì)胞懸液，不加藥物；空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞和藥物。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入預(yù)先配制好的含苦參素的培養(yǎng)液100 μl/孔，使其終濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/ml；向陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組加入培養(yǎng)液100 μl/孔。將培養(yǎng)板放置CO2孵育箱中分別孵育48、72 h。分別于44、68 h時(shí)向苦參素組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組加入5 mg/ml MTT 15 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μl，然后置于恒溫振蕩箱中，37℃、100 rpm，振蕩10 min。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于490 nm波長處測定光密度(OD)值，用復(fù)孔平均OD值進(jìn)行比較，計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率(IR)。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線，求回歸方程，得出50%抑制濃度(IC50)。

1.2.2實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測MicroRNA-122和MicroRNA-21的表達(dá)

1.2.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，取等量細(xì)胞接種于兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，吹打混勻，然后置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，1瓶細(xì)胞予常規(guī)換液處理作為未加藥的陰性對(duì)照組，另1瓶細(xì)胞予換含IC50OM(根據(jù)回歸方程，求得OM作用于HepG2細(xì)胞72 h IC50為3.2 mg/ml)培養(yǎng)液處理作為加藥的OM實(shí)驗(yàn)組。分別做好標(biāo)記，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2.2細(xì)胞總RNA的提取及RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR檢測 根據(jù)天跟公司試劑盒進(jìn)行RNA 提取和RNA逆轉(zhuǎn)錄,之后在實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟均按照試劑盒說明完成，使用Real time PCR進(jìn)行檢測MicroRNA-122和MicroRNA-21的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參,分管同機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)。陰性對(duì)照組與OM實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)同機(jī)進(jìn)行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。相對(duì)定量分析2-△△CT

1.2.2.3瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 按一定(上樣緩沖液：DNA樣品=1∶5)的比例(體積/體積)加入1.5%的瓊脂糖凝膠跑膠，條件為：80 V，30 min。停止電泳。取膠置于凝膠成像儀中進(jìn)行觀察和照相。

2 結(jié) 果

2.1苦參素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 不同濃度苦參素作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h、72 h后，發(fā)現(xiàn)苦參素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制率藥物濃度的增加及作用時(shí)間延長顯著增加(P<0.05，P<0.01)，但低濃度0.5 mg/ml OM作用48 h、72 h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故認(rèn)為0.5 mg/ml OM組對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞無增殖抑制作用。OM各濃度組作用48 h和72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 苦參素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

72 h對(duì)照組

3.2 mg/ml OM作用72 h

2.2Real-time PCR法檢測苦參素對(duì)HepG2細(xì)胞MicroRNA-122及MicroRNA-21表達(dá)的影響 OM實(shí)驗(yàn)組MicroRNA-122的表達(dá)為陰性對(duì)照組的2.79倍，MicroRNA-122表達(dá)上調(diào)。OM實(shí)驗(yàn)組MicroRNA-21的表達(dá)為陰性對(duì)照組的0.44倍，MicroRNA-21表達(dá)下調(diào)。

2.3MicroRNA-122和MicroRNA-21 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Real-time PCR反應(yīng)后為進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，予行瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)，MicroRNA-122、MicroRNA-21及U6均見單一清晰條帶，無雜帶和拖尾現(xiàn)象，說明產(chǎn)物特異性好，無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

1：Marker；2：OM實(shí)驗(yàn)組MicroRNA-122；3：陰性對(duì)照組MicroRNA-122；4：陰性對(duì)照組U6；5：OM實(shí)驗(yàn)組U6；6：陰性對(duì)照組MicroRNA-21；7：OM實(shí)驗(yàn)組MicroRNA-21；8：陰性對(duì)照組U6；9：OM實(shí)驗(yàn)組U6

3 討 論

苦參素是苦豆子等中草藥活性成分的提取物，主要含有氧化苦參堿和極少量氧化槐果堿的混合物，其中氧化苦參堿含量在98%以上，又名氧化苦參堿〔6，7〕。近年來其抗腫瘤作用的研究備受關(guān)注，以抗肝細(xì)胞腫瘤為甚，本研究發(fā)現(xiàn)苦參素對(duì)小鼠肝移植瘤有抑制作用〔8〕。有多項(xiàng)研究表明苦參素有抗腫瘤作用〔9～11〕，可通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成、抑制相關(guān)酶活性、影響腫瘤細(xì)胞的正常周期來抑制腫瘤細(xì)胞增殖；通過控制相關(guān)因子的表達(dá)來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；前期研究表明苦參素可通過影響與腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)、影響端粒酶的活性等途徑來誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔12～14〕。

劉益均等〔15〕采用MTT法觀察不同濃度和不同作用時(shí)間下OM對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制情況，發(fā)現(xiàn)苦參素藥物濃度達(dá)到1 mg/ml以上時(shí),則能顯著抑制細(xì)胞的增殖,抑制效應(yīng)隨著時(shí)間和濃度的增加呈逐漸增強(qiáng)，提示OM在體外能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OM濃度達(dá)到1.0 mg/ml以上后對(duì)HepG2細(xì)胞均有抑制作用，且隨時(shí)間增加而抑制作用更顯著，即OM對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。這與劉益均等研究結(jié)果一致。

MicroRNA(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，大約由20～22個(gè)核苷酸構(gòu)成，由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶加工后生成〔16，17〕。它們廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細(xì)胞中。miRNAs主要是與靶mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或直接是mRNA降解，能調(diào)節(jié)多種生物功能〔18〕。有研究〔19〕發(fā)現(xiàn)microRNAs在肝癌組織中異常表達(dá)，它們可能參與了肝細(xì)胞癌變及肝癌轉(zhuǎn)移的病理過程，包括MicroRNA-21、MicroRNA-122、mir-224、mir-93、mir-200a等〔20～22〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OM實(shí)驗(yàn)組中其表達(dá)上調(diào)，OM能提高肝癌細(xì)胞內(nèi)的MicroRNA-122的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果microRNA-122在肝正常組織及癌旁組織中高表達(dá)，而在肝癌組織中低表達(dá)〔23〕，同時(shí)Lin等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 是MicroRNA-122 的一個(gè)靶基因，MicroRNA-122 作用于Bcl-2 的3’UTR 后，升高M(jìn)icroRNA-122能明顯抑制Bcl-2 蛋白的表達(dá)，繼而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低和半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspase-3)活性激活，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。OM可能使肝癌細(xì)胞中MicroRNA-122表達(dá)升高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。OM能提高M(jìn)icroRNA-122的表達(dá)，這能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞向癌旁組織及正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化需行大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究表明MicroRNA-21 基因的啟動(dòng)子受核因子(NF)-κB、激活蛋白(AP)-1〔25〕、NFIB和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)〔26〕等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。Meng等〔27〕研究小組利用基因芯片技術(shù)對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中miRNA 的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示MicroRNA-21 在肝癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞高9 倍，并且外源MicroRNA-21 的導(dǎo)入可抑制腫瘤抑制基因磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)的功能，明顯增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增值、侵襲及遷移能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OM實(shí)驗(yàn)組中MicroRNA-21表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞數(shù)目減少， MicroRNA-21在HepG2細(xì)胞中可能起到癌基因作用，經(jīng)過OM處理后的HepG2細(xì)胞中MicroRNA-21表達(dá)下調(diào)，其誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖受到抑制，從而細(xì)胞數(shù)目減少。OM可能通過下調(diào)MicroRNA-21的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，OM濃度達(dá)到1.0 mg/ml以上后對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用，且具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。OM可上調(diào)HepG2細(xì)胞的MicroRNA-122表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，由于本實(shí)驗(yàn)存在局限，OM能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化需進(jìn)一步行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。MicroRNA-21作為癌基因，OM作用后可下調(diào)其表達(dá)，說明OM抑制肝癌作用的機(jī)制可能與下調(diào)MicroRNA-21表達(dá)有關(guān)。

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