小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤大鼠微血管密度和腫瘤細胞增殖活性的影響

于慧玲 麻春杰 蓋 聰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

C6膠質(zhì)瘤一般為膨脹性或侵襲性生長，其血管的生成和腫瘤細胞的不斷增殖，在C6膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的意義〔1〕。小柴胡湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑，臨床應(yīng)用廣泛，近年來其在腫瘤治療方面的應(yīng)用日益引起人們的重視〔2〕，本實驗采用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織的微血管密度(MVD)反映腫瘤的微血管生成情況；同時通過檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達反映腫瘤細胞的增殖活性，旨在探討小柴胡湯的抑瘤機制，為其進一步推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 小柴胡湯組成：柴胡(78.125 g)、黃芩(46.875 g)、人參(46.875 g)、清半夏半升(42 g)、炙甘草(46.875 g)、生姜(46.875 g)，大棗(30 g)。替莫唑胺由江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供；ELISA試劑盒：CD34和PCNA均由南京建成生物有限公司提供；一抗CD34和PCNA購于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2實驗分組及模型制備〔3〕清潔級Wistar 老年雄性大鼠，體重(321.5±3.3)g，18月齡， 60只右前肢腋窩皮下接種2×106/20 μl的C6膠質(zhì)瘤細胞懸液；隨機分為腫瘤對照組、陽性藥A組(替莫唑胺50 mg/kg)、陽性藥B組(替莫唑胺25 mg/kg)、小柴胡湯C組(50 g/kg)、小柴胡湯D組(20 g/kg)、小柴胡湯E組(10 g/kg)。

1.3中藥制備 小柴胡湯組成中的7味中藥，以8倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱保持微沸30 min，過濾；殘渣加6倍量蒸餾水，微沸30 min，過濾，合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至100 ml，即小柴胡湯E(10 g/ml)；以類似方法濃縮熬制小柴胡湯D(20 g/ml)；小柴胡湯C(50 g/ml)；4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4給藥方法及取材 每組均分別灌胃給予生理鹽水、陽性藥A、陽性藥B、小柴胡湯C、小柴胡湯D和小柴胡湯E，連續(xù)服藥5 d，休息4 d，共給藥3次，于最后1次給藥后2 d處死動物，眼球取血，分離血清3 000 r/min，10 min，標(biāo)記好后置-20℃保存?zhèn)溆?；取腫瘤組織(部分-20℃凍存待測，部分固定于10%甲醛液中)。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量的檢測 采用ELISA酶聯(lián)免疫法檢測；嚴格按照試劑盒方法操作。

1.5.2大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白水平的檢測 采用免疫組織化學(xué)方法檢測；腫瘤組織脫水、包埋、切片4 μm，60℃烤箱烘烤6 h待測。

1.5.3大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數(shù)的檢測 MVD的計數(shù)是在200倍光學(xué)顯微鏡下，連續(xù)計數(shù)5個視野的微血管數(shù)的平均值；增殖指數(shù)的檢測：在200 倍光學(xué)顯微鏡下，連續(xù)計數(shù)5個視野的PCNA陽性細胞數(shù)/計數(shù)的細胞總數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)，陽性藥各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白含量亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)。見表1。

2.2各組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白水平陽性強度的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白陽性表達強度均降低(P<0.01)，C組、D組降低較為顯著但二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；陽性藥各劑量組大鼠腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白陽性表達亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯(P<0.01)，陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD34和PCNA蛋白陽性表達強度采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)檢測灰度值，灰度值越大陽性表達越低，灰度值越小陽性表達越高。見表2。

2.3各組大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數(shù)的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯和陽性藥各劑量組大鼠腫瘤組織中MVD和增殖指數(shù)均下降(P<0.01)，陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤大鼠血清、腫瘤組織中CD34、PCNA蛋白含量的影響

表2 小柴胡湯對C6膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中CD34、PCNA蛋白水平(灰度值)和MVD、增殖指數(shù)的影響

2.4腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白、MVD和增殖指數(shù)的相關(guān)性比較 腫瘤組織中CD34和PCNA蛋白呈正相關(guān)(r=0.735，P<0.01)，MVD和增殖指數(shù)亦呈正相關(guān)(r=0.726，P<0.01)。

3 討 論

大量研究〔4〕表明，腫瘤的生長和擴散與血管的形成密切相關(guān)，新生血管不僅為腫瘤組織的生長繁殖提供血供及氣體營養(yǎng)，更為腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移提供了可靠的通道。CD34是一種特異度較高的血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物，通過抗體與相應(yīng)的內(nèi)皮細胞結(jié)合，可以直接反映MVD的生成狀況，目前許多學(xué)者將腫瘤MVD作為腫瘤微血管生成的標(biāo)志進行研究〔5，6〕。PCNA表達于腫瘤細胞的細胞核，是一種細胞增殖相關(guān)蛋白，反映細胞的增殖活性；它是一種僅在增殖細胞中合成與表達的酸性非組胺核蛋白，是DNA復(fù)制合成過程中的必需物質(zhì)，并且在DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，它的表達僅局限于細胞核內(nèi)；它在增殖細胞周期中含量的變化與DNA復(fù)制時相變化具有一致性，是評價細胞增殖的良好指標(biāo)〔7，8〕。C6膠質(zhì)瘤生長迅速且呈惡性侵襲性發(fā)展，其中廣泛間質(zhì)微血管形成是膠質(zhì)瘤生長的生物學(xué)基礎(chǔ)，腫瘤細胞的增殖活性及腫瘤的微血管形成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要核心作用，但目前關(guān)于膠質(zhì)瘤血管生成的機制尚不清楚，因此PCNA和CD34的表達狀況與腫瘤的侵襲性、發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上，小柴胡湯可抑制C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性及微血管形成，降低腫瘤組織PCNA和CD34的陽性率，但其間的相互關(guān)系及機制仍需進一步研究加以論證。本研究結(jié)果也為進一步探討腫瘤細胞的增殖與微血管形成間的相關(guān)性及PCNA和CD34的靶向治療提供一定參考。

4 參考文獻

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