血必凈對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及心肌AngⅡ和Toll受體-4表達(dá)的影響

王葉舟

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部病房，福建 福州 350003)

內(nèi)毒素血癥(ETM)是一種臨床常見(jiàn)的危重急癥，主要病因?yàn)榧?xì)菌釋放大量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入血液，不僅可繼發(fā)器官損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致休克甚至死亡〔1〕。內(nèi)毒素在ETM發(fā)病中僅起觸發(fā)作用，而由內(nèi)毒素引發(fā)的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要，多種炎癥因子參與了ETM的發(fā)病過(guò)程，因此控制炎癥反應(yīng)是緩解ETM的根本措施〔2,3〕。心臟是ETM的主要受累器官，機(jī)體釋放的一系列炎癥因子，可影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)，導(dǎo)致循環(huán)障礙，加重了細(xì)胞缺血、缺氧〔4，5〕。Toll樣受體4(TLR-4)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在ETM大鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)升高〔6〕。血必凈(XBJ)是一種中藥材提取物，具有活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、潰散毒邪的作用，可拮抗內(nèi)毒素并抑制炎癥反應(yīng)〔7〕，故推測(cè)XBJ也可用于ETM治療。本研究觀察XBJ對(duì)ETM炎癥反應(yīng)的改善作用，同時(shí)分析其對(duì)心肌血管緊張素(Ang)Ⅱ和TLR-4水平的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與主要儀器 脂多糖(LPS)、Triton X100，美國(guó)Sigma公司；兔抗鼠β-actin、TLR-4一抗、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，美國(guó)Santa Cruz公司；BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司；血漿腫瘤壞死因子(TNF)-α、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和白介素(IL)-6，南京建成生物工程研究所；AngⅡ試劑盒，中國(guó)北方生物技術(shù)研究所；TLR-4、β-actin引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；XBJ注射液(10 ml/支)，天津紅日藥業(yè)。

1.2動(dòng)物與分組 選取8周齡的雄性SD大鼠30只并采用陰莖背靜脈注射8 mg/kg LPS誘導(dǎo)ETM大鼠模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分3組(n=10)：LPS組，LPS+ XBJ組和LPS+地塞米松(DEX)組。LPS+XBJ組和LPS+DEX組在注射LPS的同時(shí)分別給予XBJ 5 ml/kg和DEX 5 mg/kg。選取同批次的10只正常大鼠作對(duì)照(對(duì)照組)，僅給予等體積生理鹽水。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前均飼養(yǎng)于相同環(huán)境下(安靜、濕度60%～70%且12 h/12 h明暗周期)，可自由獲取飲水、飲食。實(shí)驗(yàn)前均至少喂養(yǎng)1 w，待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.3血漿炎癥因子及心肌AngⅡ檢測(cè) 3 h后從右側(cè)頸總動(dòng)脈采血置于抗凝管中，4℃ 5 000 r/min離心5 min，保留上清，同時(shí)靜脈注射1 ml KCl使大鼠心臟停在舒張期，迅速取出心臟，采用中性PBS(pH7.4)漂洗，濾紙吸干后修剪心臟，保留左心室并將其剪碎，充分勻漿后12 000 r/min離心10 min，保留上清，樣本均于低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法檢測(cè)各組血漿TNF-α、CRP和IL-6水平，放射免疫法檢測(cè)心肌組織中AngⅡ水平。以上操作均嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4Western印跡法 采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白法檢測(cè)心肌組織上清液TLR-4蛋白濃度，加入上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min后每孔加入30 μg蛋白，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后，根據(jù)膜面積加入TLR-4(1∶200)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，選擇β-actin為內(nèi)參(1∶3 000)，每步間采用TBST沖洗。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采用 Image Pro Plus軟件分析目的條帶的光密度。

1.5RT-PCR法 采用RNA提取試劑盒提取心肌細(xì)胞的總RNA，干燥RNA沉淀并保存于適量DEPC水中，-80℃保存?zhèn)溆?，檢測(cè)260、280 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)并計(jì)算A260/A280，同時(shí)采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。PCR總反應(yīng)體系為25 μl，包含2 μl引物(20 μmol/L)、2.5 μl dNTP混合液、0.5 μl AMV-Optimized Taq酶、5 μl MgCl2(25 mmol/L)及4 μg總RNA。TLR-4引物：5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′(正義)，5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′(反義)；內(nèi)參β-actin：5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′(正義)，5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′(反義)。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50℃、30 min，94℃、2 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶酶；94℃、30 s(變性)，57℃、30 s(變性)，72℃、30 s(延伸)，共30個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)分析，TLR-4 mRNA表達(dá)量以其與內(nèi)參的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1血必凈對(duì)ETM大鼠血漿炎癥因子水平的影響 LPS組、LPS+XBJ組和LPS+DEX組的血漿炎癥因子水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，LPS+XBJ組的TNF-α和IL-6水平均低于LPS組(P<0.05)，與LPS+DEX組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但LPS+XBJ組的CRP與LPS組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且高于LPS+DEX組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血漿炎癥因子水平比較

2.2血必凈對(duì)ETM大鼠心肌AngⅡ水平的影響 對(duì)照組、LPS組、LPS+XBJ組和LPS+DEX組的心肌AngⅡ水平分別為(68.24±10.28)、(793.85±98.01)、(351.60±75.64)、(149.37±66.82)ng/g，LPS組高于對(duì)照組(P<0.05)，XBJ處理可降低LPS誘導(dǎo)的AngⅡ升高(P<0.05)，但與對(duì)照組和LPS+DEX組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS+DEX組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3血必凈對(duì)ETM大鼠心肌TLR-4 mRNA、蛋白水平的影響 LPS組的TLR-4 mRNA、蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.05)，XBJ處理可降低LPS誘導(dǎo)的TLR-4 mRNA、蛋白水平升高，且與對(duì)照組和LPS+DEX組仍有顯著差異(P<0.05)。LPS+DEX組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

1:對(duì)照組;2:LPS組;3:LPS+XBJ組;4:LPS+DEX組

表2 各組心肌TLR-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平

3 討 論

炎癥反應(yīng)在ETM發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可損傷臟器并影響系統(tǒng)功能，故應(yīng)及時(shí)緩解ETM的炎癥反應(yīng)〔2〕。XBJ的主要成分為紅花黃色素A，在臨床上對(duì)多種細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)均有較好的治療效果，如重癥膿毒癥、百草枯中毒及重癥胰腺炎等〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)給予ETM大鼠XBJ治療后，可降低其血漿TNF-α、CRP和IL-6水平，表明XBJ對(duì)ETM的炎癥反應(yīng)有保護(hù)作用，主要與其具有活血化瘀、潰散毒邪和疏通經(jīng)絡(luò)的功效有關(guān)，可拮抗內(nèi)毒素的作用〔8〕。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是ETM的常見(jiàn)病理生理反應(yīng)，主要與炎癥反應(yīng)釋放的大量炎癥因子有關(guān)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)可影響心血管系統(tǒng)功能，導(dǎo)致循環(huán)障礙，加重細(xì)胞缺血缺氧，導(dǎo)致病情惡化〔9〕。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要組成部分，其水平可用于評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的激活狀態(tài)〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)ETM大鼠的心肌AngⅡ水平升高，提示ETM時(shí)心肌的腎素-血管緊張素系統(tǒng)處于激活狀態(tài)。XBJ可降低心肌AngⅡ水平，表明XBJ可抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，主要與其降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。以上提示XBJ對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

Toll樣受體在ETM的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。心臟是ETM的主要損傷器官，ETM大鼠心肌TLR-4水平升高，提示Toll樣受體被激活，在介導(dǎo)心臟局部炎癥反應(yīng)中起作用〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)XBJ可降低心肌TLR-4的蛋白和mRNA水平，進(jìn)一步表明XBJ對(duì)ETM心肌損傷的保護(hù)作用。但本研究中經(jīng)XBJ處理后，血漿炎癥指標(biāo)及心肌AngⅡ和TLR-4水平仍與正常大鼠有差異，推測(cè)主要原因?yàn)閯┝坎蛔慊蜃饔脮r(shí)間較短，這將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1方迎艷,郭曉磊,馬 麗,等.內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌功能障礙和肌漿網(wǎng)鈣泵基因表達(dá)的變化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2012;32(23):5167-9.

2李 紅,趙龍鳳,郝彥琴,等.抗組胺治療對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝炎大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥和肝臟炎癥的影響〔J〕.中華臨床感染病雜志,2013;6(4):221-5.

3蔣國(guó)洪,馮旭明,詹愛(ài)丁,等.烏司他丁和血必凈抑制早期內(nèi)毒素血癥大鼠炎癥反應(yīng)的對(duì)比研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2013;51(23):1-2,6.

4張麗麗,呂敏麗,張慧英等.GRP78在肝硬化大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥引發(fā)心臟病變中的作用〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,2012;28(4):577-82.

5李晶鈴,陰赪宏,王 超,等.內(nèi)毒素血癥時(shí)循環(huán)腎素-血管緊張素系統(tǒng)改變的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2006;18(2):92-5.

6王葉舟,謝良地,韓 英,等.烏司他丁對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠心肌TOLL樣受體4表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2011;31(24):4851-3.

7許競(jìng)艷,嚴(yán) 敏,陳 鋼,等.血必凈對(duì)兔創(chuàng)傷性腦損傷腦細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2013;22(7):741-3.

8姜偉青,王建偉,彭保國(guó),等.血必凈注射液對(duì)嚴(yán)重胸部外傷患者應(yīng)急及免疫狀態(tài)影響的研究〔J〕.中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2013;33(8):695-7.

9張曉平,張 峰,陸 茵,等.肝纖維化中腎素-血管緊張素的作用研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011;27(7):897-900.

10朱 清,薩仁高娃,岳 欣,等.腎素血管緊張素拮抗劑對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)的抑制作用〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2011;30(4):337-41.