皖北地區(qū)Leber遺傳性視神經(jīng)病一家系線粒體突變位點(diǎn)

劉 輝 王 力 鮑明升 王愛蓮 吳守偉 趙 莉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)目前認(rèn)為是受母親遺傳的一種視神經(jīng)病，發(fā)病多為年輕男性，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為急性或亞急性雙眼中心視力下降，通常不伴有眼球疼痛；視野以中心或偏中心暗點(diǎn)居多，通常暗點(diǎn)較大并可向周邊擴(kuò)展，更易向上方延伸或連接包繞生理盲點(diǎn)；視力大多穩(wěn)定在0.1以下，雖有全盲者但罕見〔1～4〕。本研究探索皖北地區(qū)該病是否有突變位點(diǎn)。

1 病例與方法

1.1病例來源 該病家系來源于皖泗縣地區(qū)，經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院診斷為LHON，患者為15歲女性，其母親為攜帶者，表型正常。舅舅45歲，亦為患者。

1.2基因組DNA提取 在患者及其家屬簽署知情同意書后，對患者抽取靜脈血2～3 ml，并對其家系進(jìn)行走訪，并抽取其母親和舅舅外周血進(jìn)行研究。使用全血基因組抽提試劑盒(天根生化科技，北京)提取外周血基因組DNA。為避免外源DNA污染，總DNA提取采用無菌濾紙代替血液樣品作陰性對照，提取方法與其他樣品完全一樣。

1.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù)人類線粒體全序列(GenBank登錄號：JQ031816)分別設(shè)計(jì)ND1基因、ND4基因和ND6基因引物。

設(shè)計(jì)引物對FP(L3202)和RP(L4424)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 242 bp，涵蓋全部ND1基因956 bp；由于ND4基因較長，設(shè)計(jì)兩個引物對FP(L10664)和RP(L11489)、FP(L11416)和RP(L12225)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為849 bp和834 bp，拼接后可包含全部ND4基因1 378 bp；設(shè)計(jì)引物對FP(L14041)和RP(L14837) 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為816 bp，涵蓋全部ND6基因525 bp。見表1。

表1 引物名稱及序列

1.4ND1，ND4和ND6基因擴(kuò)增及測序 PCR擴(kuò)增使用Long Taq DNA聚合酶試劑盒(天根生化科技，北京)，擴(kuò)增線粒體ND1基因、ND4基因和ND6基因；PCR體系為25 μl，含0.5 μg 模板DNA，上、下游引物各0.5 μl(濃度為10 μmol/L)，Long Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μl)0.5 μl，10×Long Taq Buffer 12.5 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μl，最后用ddH2O補(bǔ)充體積至25 μl。每個反應(yīng)包含30循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，首次循環(huán)前95℃預(yù)變性5 min，最后一個循環(huán)后72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)在PTC-200 Thermo Cycler (MJ Research公司)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用無菌濾紙的提取結(jié)果替代模板作陰性對照。擴(kuò)增結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)(BioRad公司)拍照分析。擴(kuò)增得到的ND1基因、ND4基因和ND6基因產(chǎn)物直接送上海Invitrogen公司測序。

1.5BLAST及數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，以確定所測得序列的正確性。然后用CLUSTAL X軟件與正常人對應(yīng)位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行比對，以尋找是否有新的突變位點(diǎn)，并用MEGA 2.0軟件對所測DNA序列進(jìn)行蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，并探索突變位點(diǎn)是否會引起氨基酸殘基的改變。

2 結(jié) 果

2.1突變位點(diǎn)分析 發(fā)現(xiàn)2個新的突變位點(diǎn)，且具有家系遺傳特點(diǎn)：第一個突變位點(diǎn)，位于ND4基因內(nèi)線粒體全序列第11 196位，由T突變?yōu)镃(圖1，圖2)；第二個突變位點(diǎn)，位于ND4基因內(nèi)線粒體全序列第11 770位，由G突變?yōu)锳(圖3，圖4)。

2.2突變位點(diǎn)對應(yīng)預(yù)測氨基酸的分析 所測線粒體DNA序列用MEGA2.0軟件預(yù)測氨基酸序列，密碼子表選用verteabrate mitochondria，來判斷所測線粒體DNA序列中所發(fā)生的變異位點(diǎn)是否會造成氨基酸序列的改變，從而探討與LHON的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)ND1，ND4和ND6基因中，兩個變異位點(diǎn)所對應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了改變。在ND4基因中，對應(yīng)的氨基酸由苯丙氨酸(F)變?yōu)榱涟彼?L)；精氨酸(R)變?yōu)榻M氨酸(H)(圖5)這兩個變異的位點(diǎn)在這個家族的三個成員中均出現(xiàn)，但是否由于這兩個變異位點(diǎn)引起的疾病尚不能下結(jié)論，還需深入研究。

方框內(nèi)示突變位點(diǎn)；ND4、DN4 NPH2和DN4 NP183：正常人線粒體序列，1-ND4和3-ND4為該家系中患者線粒體序列，2-DN4，為該家系中攜帶者線粒體序列；*正常位點(diǎn)

圖2 該家系線粒體ND4基因中第一個突變位點(diǎn)處測序圖譜(無亂峰，信號可信)

方框內(nèi)示突變位點(diǎn)；ND42、DN42 NP183和DN42 NPH2：正常人線粒體序列，1-ND42和3-ND42為該家系中患者線粒體序列，2-DN42，為該家系中攜帶者線粒體序列；*正常位點(diǎn)

圖4 該家系線粒體ND4基因中第2個突變位點(diǎn)處測序圖譜(無亂峰，信號可信)

圖5 突變位點(diǎn)對應(yīng)氨基酸變化

3 討 論

LHON是一種比較少見的遺傳性視神經(jīng)病，有明顯家族史，但遺傳方式頗為特殊，與孟德爾定律不符，多數(shù)患者為男性，僅通過女性傳遞。在20世紀(jì)80年代以前，對于該疾病的發(fā)病原因有多種解釋，直到近年來，各國學(xué)者才普遍認(rèn)為是由于線粒體的某些基因的位點(diǎn)突變引起的。目前的研究發(fā)現(xiàn)該病的主要突變位點(diǎn)發(fā)生在編碼線粒體呼吸鏈上的NADH脫氫酶(或復(fù)合物Ⅰ)的亞基中〔5，6〕，從而導(dǎo)致呼吸鏈上的復(fù)合物發(fā)生改變而引起LHON的發(fā)生。目前已知有3個不同的mtDNA原發(fā)性突變，分別發(fā)生在線粒體核苷酸序列的3460A/ND1，11778A/ND4和14484C/ND63個位點(diǎn)，這3個原發(fā)性突變位點(diǎn)被認(rèn)為是引起LHON的較強(qiáng)的風(fēng)險因素〔2，7〕，但是，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些新的線粒體序列點(diǎn)突變對于該病的發(fā)生也起到一定至關(guān)重要的作用〔8～11〕。

自Wallace等〔5〕首先發(fā)現(xiàn)LHON可因線粒體DNA核苷酸位點(diǎn)突變引起以來，越來越多的研究人員發(fā)現(xiàn)各種不同的mtDNA點(diǎn)突變與本病有密切關(guān)系。ND基因在線粒體的研究中越來越受到重視，本研究發(fā)現(xiàn)，皖北地區(qū)該家系的患者在常見的3個突變位點(diǎn)3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6并未發(fā)生點(diǎn)突變，而是有兩個新的突變位點(diǎn)：第一個突變位點(diǎn)，位于ND4基因內(nèi)線粒體全序列第11 196位，為T11196C；第二個突變位點(diǎn)位于ND4基因內(nèi)線粒體全序列第11 770位，為G11770A。變異位點(diǎn)對應(yīng)的氨基酸殘基也隨之發(fā)生改變，說明該位點(diǎn)的變異是有意義的，可能是與該疾病的發(fā)生有關(guān)。目前為止，國內(nèi)相關(guān)研究報道有涉及T14484C 和T14502C〔12〕，G3460A〔13〕，還有ND基因以外其他基因的突變，例如tRNAThr A15951G〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)的新的變異位點(diǎn)只能推測與該疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系，如果要證明某個變異位點(diǎn)與該疾病的發(fā)生有因果關(guān)系，還需要更多的病例和深入的研究。對于新的變異位點(diǎn)是否是突變，還要排除基因多態(tài)性方面的可能，目前還沒有可靠的標(biāo)準(zhǔn)，只能參照已知的多態(tài)性位點(diǎn)。通過我們的研究，認(rèn)為在臨床上檢測，可以通過位點(diǎn)特異性PCR對常見的3個突變位點(diǎn)3460A/ND1、11778A/ND4和14484C/ND6以及T11196C和G11770A進(jìn)行篩查。

4 參考文獻(xiàn)

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