叉頭盒蛋白M1和基質金屬蛋白酶-2在非小細胞肺癌中的表達及意義

張新宇 王紹清

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

叉頭盒蛋白M1(FoxM1)是 Fox亞家族成員之一，是一種與增殖相關的特異性轉錄因子。已有研究〔1～3〕表明， FoxM1的高表達與腫瘤的生長、侵襲及轉移密切相關。明膠酶A是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族重要成員之一，具有降解細胞外Ⅳ膠原成分、促進腫瘤的侵襲和轉移的作用〔4,5〕。本研究主要應用免疫組織化學方法檢測非小細胞肺癌(NSCLC)中FoxM1和MMP-2的表達情況，探討它們與NSCLC臨床分期、病理類型、淋巴結轉移等臨床病理學特征之間的關系，為NSCLC預后的評估及治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1對象 選取2005年4月至2007年1月在本院就診經外科手術切除并存檔的NSCLC石蠟標本60例。所有患者術前均未接受任何放化療。其中男41例，女19例，年齡47～78歲，中位年齡62歲； 鱗癌38例，腺癌19例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例。采用美國MD Anderson醫(yī)學中心和國立癌癥研究所肺癌研究組(UICC)制訂的第6版肺癌TNM分期標準進行分期〔6〕：T1期26例，T2 期28例，T3期5例，T4期1例；N0期44例，N1期14例，N2期2例；M期0例。臨床TNM分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期5例。兔抗人FoxM1多克隆抗體購于Santa Cruz 公司(美國，SC-502)，兔抗人MMP2多克隆抗體購于Santa Cruz 公司(美國，SC-10736)。SP免疫組化檢測試劑盒(中國，SP9100)和DAB(中國，ZLI-9017)顯色液均購自北京中山生物技術有限公司。

1.2實驗方法 取石蠟包埋組織4 μm厚度連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、置入抗原修復液(枸櫞酸)中修復5 min。采用SP法免疫組化染色，兔抗人FoxM1多克隆(1∶200)，兔抗人MMP-2多克隆抗體(1∶200)，具體操作按說明書進行。二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染。堿性磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3判斷標準 高倍鏡下隨機選取5個視野觀察200個細胞，細胞質或細胞膜內呈現清晰棕黃色顆粒染色的為陽性細胞。對所觀察視野細胞進行染色強度和染色范圍綜合評分〔7〕。細胞染色強度評分：0分(陰性，無染色)，1分(弱陽性，淺黃色顆粒)，2分(陽性，棕黃色顆粒)，3分(強陽性，深褐色顆粒)。細胞染色范圍評分：0分(0%)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。每張切片染色強度和染色范圍的和作為最后的染色評分(0～7分)，≥4分認為該切片染色結果為陽性。

1.4統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行分析，計數資料比較采用χ2檢驗，蛋白表達之間的相關性分析應用Spearman等級相關分析法。

2 結 果

2.1FoxM1及MMP-2在NSCLC組織中級癌旁正常肺組織中的表達 FoxM1蛋白陽性表達主要定位于細胞質，少量表達于細胞核。NSCLC組織中FoxM1蛋白陽性表達率為 43.3%(26/60)(圖1)，癌旁肺組織中為9.1%(1/11)，NSCLC組織中FoxM1的表達率明顯高于正常組織(χ2=4.625，P<0.05)。MMP-2蛋白陽性表達主要定位于細胞質。NSCLC組織中MMP-2蛋白陽性表達率為68.3%(41/60)(圖1)，癌旁肺組織中為0%(0/11)，NSCLC組織中MMP-2的表達率明顯高于正常組織(χ2=17.789，P<0.05)。

2.2FoxM1及MMP-2表達與NSCLC臨床病理特征的關系 FoxM1的表達與患者性別、腫瘤的組織學類型無關(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、腫瘤大小、是否有淋巴結轉移、臨床TNM分期及患者是否吸煙有關(P=0.007，0.009，0.003,0.002,0.043)。MMP-2的表達與患者性別、組織學分型、T分期、臨床TNM分期及患者是否吸煙無關(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、是否有淋巴結轉移(P=0.011，0.034)有關。見表1。

2.3FoxM1及MMP-2蛋白表達的相關性 在NSCLC組織中FoxM1和MMP-2同時表達陽性的有22例，同時表達陰性的有15例，FoxM1表達陽性而MMP-2表達陰性的有4例，FoxM1表達陰性而MMP-2表達陽性的有19例。Spearman等級相關分析結果顯示，兩者在NSCLC中表達呈顯著正相關(r=0.306，P=0.010)。

表1 FoxM1及MMP-2蛋白表達與NSCLC臨床病理參數的關系〔n(%),n=60〕

3 討 論

肺癌是最常見的呼吸系統腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響人們的生活質量。盡管現在治療手段的不斷提高，但是NSCLC患者5年生存率仍然較低〔8〕，在分子水平尋找肺癌可能的治療靶點備受關注。 FoxM1為Fox基因家族成員之一，該家族成員機構的共同特征由110個氨基酸組成的進化保守的同源DNA結合區(qū)(DBD)，稱為“叉頭框”。FoxM1在維持細胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡重發(fā)揮重要的作用，是一種增殖相關的轉錄因子〔1〕。目前研究表明，FoxM1在多種惡性腫瘤中均存在高表達〔1～3〕，并且其高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

鑒于FoxM1具有促進腫瘤細胞生長的作用〔9〕，一些研究已經對FoxM1是否能作為一種預測NSCLC患者的臨床預后指標進行了研究。其中包括： 在肺鱗癌中，FoxM1的表達與肺癌分化及患者預后關系密切〔10〕；FoxM1可以作為預測肺、鱗癌和腺癌患者預后的一個獨立因素，但FoxM1的表達和臨床病理學特征之間沒有任何關系〔11〕。 這些結果的不同可能是由于不同研究對象、不同樣本量和不同診斷標準有關。本研究結果提示FoxM1的表達與NSCLC的發(fā)生密切相關，與其他學者〔10〕的研究結果相似。Gialmanidis等〔12,13〕研究認為 FoxM1的表達與NSCLC分化、是否淋巴結轉移密切相關與NSCLC的組織學類型、淋巴結轉移有關。而本組研究結果顯示FoxM1的表達參與NSCLC的發(fā)展過程，可能是影響患者預后的重要因素之一。

因為淋巴結轉移和臨床分期都是影響患者預后的主要因素，提示FoxM1與NSCLC的進展有密切關。有學者〔14〕下調FoxM1表達后，NSCLC細胞體外遷移和侵襲能力下降，并且下調肺癌細胞中FoxM1的表達的同時MMP-2表達水平也下調，說明FoxM1促進腫瘤細胞侵襲的作用與調控MMP-2表達有關。腫瘤的轉移涉及一系列復雜的步驟,包括腫瘤細胞間的附著力下降、細胞的附著、基質的溶解和遷移合成及分泌大量基質降解酶 是腫瘤侵襲轉移的重要步驟〔15〕。其他一些研究表明，MMP已成為在瘤局部生長和遠處轉移的中心因素〔15,16〕。本研究結果提示MMP-2 的過表達與NSCLC 預后不良密切相關，并表明FoxM1可能通過調控MMP-2表達參與肺癌侵襲和轉移的過程。

綜上，本文FoxM1參與NSCLC組織中的發(fā)生、發(fā)展過程。FoxM1促進肺癌侵襲和轉移過程與激活MMP-2信號有關。FoxM1可能成為腫瘤治療的一個靶點，本研究為以FoxM1為靶點的治療提供了實驗依據，但是其在不同類型肺癌中的作用尚需進一步研究。

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